PAIso-seq技术首登NC——深入揭示RNA Poly (A)尾全貌

[安诺优达]

如果您无法正常查看，请点击在线浏览

PAIso-seq技术首登NC——深入揭示RNA Poly (A)尾全貌

2019年11月22日，中科院遗传与发育生物学研究所陆发隆研究组基于PacBio Iso-Seq开发了一种兼具灵敏和准确性的poly (A) 尾检测技术PAIso-seq，并在线发表于Nature Communications上， 安诺基因在本次研究中承担了三代PacBio测序的工作。

 

英文题目：Poly(A) inclusive RNA isoform sequencing (PAIso-seq) reveals wide-spread non-adenosine residues within RNA poly(A) tails；

中文题目：PAIso-seq揭示RNA poly(A)尾中广泛存在的非A碱基；

发表杂志：Nature Communications;

影响因子：11.878；

发表时间：2019.11.22；

合作单位：中科院遗传与发育生物学研究所。

研究背景：Poly (A)尾是mRNA和部分lncRNA上的重要组成结构，可以调节RNA的稳定性和翻译效率。由于技术手段的限制，常规的二代转录组测序技术无法实现对poly(A)尾长度和组成的精确分析，因此以往对这一结构的研究相对较少。本文基于PacBio Iso-Seq开发了一种兼具灵敏和准确性的poly (A) 尾检测技术PAIso-seq，实现了对RNA poly (A)尾序列的测定，并发现其主体上广泛存在的非A碱基。

样本选择：GV期小鼠卵母细胞

测序策略：PacBio Sequel测序，构建保留RNA poly (A)尾的PAIso-seq文库

实验设计：

主要结果：

1.PAIso-seq可准确分析poly (A)尾

目前可对poly (A)尾进行分析的方法都存在一定的限制：二代测序无法对同聚物长序列进行读取，此前报道过的TAIL-seq和PAL-seq则无法对poly (A)尾中的非A碱基进行读取。 PacBio测序因其可读取同聚物及环状测序提升准确度的特点，成为了精准分析poly (A)尾长度和组成的首选。 作者通过末端延伸、模板置换、全长cDNA扩增和环状接头连接等一系列处理构建了保留RNA poly (A)尾的PAIso-seq文库。研究者设置了三组生物学重复实验，其中两组是群体细胞水平的研究，另一组是单细胞水平的研究。通过分析三组数据，研究者共获得11,538个基因含有至少一条转录本，其中有8,281个基因含有至少三条转录本。

PAIso-seq技术流程

2.PAIso-seq具有良好的可重复性

为验证PAIso-seq的可重复性，作者分析了poly (A)尾长度，发现不论在基因还是转录本水平，每组重复间都表现出很强的相关性（下图abd）。以往的检测手段如TAIL-seq等均有长度限制，因此传统上认为poly (A)尾最长约250nt。 PAIso-seq一个明显的特点是没有长度上限 ，且研究中发现约有0.1%的poly (A)尾长于260nt（下图e）， 颠覆了以往对poly (A)尾长度的认知。

PAIso-seq具有良好的可重复性

3.识别不同isoforms上的poly (A)尾

利用PAIso-seq技术可以实现对每个基因不同isoform上poly (A)尾的分析 ，包括APA位点和可变剪切。研究中发现3,511个基因含有1个APA位点，982个基因含有至少2个APA位点（下图a），且不同isoforms可能含有不同的poly (A)尾，如Ccnb1转录本有3个不同的APA位点，导致其出现3种不同长度3’-UTR区域(下图bc)。

PAIso-seq技术可检测不同isoforms上的poly (A)尾

4.poly (A)尾长度与卵母细胞翻译过程相关

基于GV期卵母细胞的蛋白表达情况，作者将转录本分为蛋白表达量高与表达量低两组，并比较它们的poly (A)尾平均长度。高表达组的平均长度为62nt,明显长于低表达组的56nt（下图a）。poly (A)尾长度与蛋白表达水平呈正相关，表明较长的poly (A)尾会促进卵母细胞中的翻译过程。KEGG通路分析的结果也表明，高表达组的基因与正在发生的功能有关，如蛋白酶和蛋白加工；而低表达组的基因则与即将发生的功能有关，如细胞周期和减数分裂（下图b）。

poly (A)尾长度与蛋白表达水平相关

5.poly (A)尾主体区域广泛分布非A碱基

此前研究中普遍认为poly (A)尾仅含有A碱基，TAIL-seq曾揭示poly (A)尾的3’末端还存在G和U碱基。 本次研究通过PAIso-seq发现在poly (A)尾主体上广泛存在着U、G、C碱基， 占卵母细胞17%的转录本（下图a）。U碱基更多出现在poly (A)尾较短的转录本中，G和C碱基较多出现在poly (A)尾较长的转录本中（下图b）。除单个出现外，非A碱基也会呈2、3、4个连续出现（下图c）。这些结果表明 PAIso-seq可以准确测定poly (A)尾的组成，其结构较以往的认知更加复杂。

poly (A)尾主体区域广泛分布非A碱基

6.单细胞PAIso-seq

最后作者将单个细胞的数据和正常样品的数据进行比较，发现两者在poly (A)尾长度和非A碱基分布上都呈现出良好的相关性，表明PAIso-seq可以在单细胞水平进行应用。

总结

综上，PAIso-seq技术能够实现对poly (A)尾进行高灵敏度和高准确度的测定，探究isoform特异性poly (A)尾并揭示其主体中U、G、C碱基的多样化组成，为进一步研究poly (A)尾的功能和调控开启了关键性的大门。

自2017年推出三代测序服务以来，安诺优达先后引进了10台PacBio Sequel和4台Sequel II测序仪，产品服务类型涵盖三代基因组组装、人重测序、动植物重测序、全长转录组测序等，累计完成三代项目超800+。2019年7月，安诺优达测序实验室又荣获PacBio官方认证测序服务商证书。安诺优达将秉承客户至上的服务理念为合作伙伴提供更快速、更优质的三代测序服务。

参考文献：

1. Liu Yusheng., Nie Hu., Liu Hongxiang., Lu Falong., (2019). Poly(A) inclusive RNA isoform sequencing (PAIso-seq) reveals wide-spread non-adenosine residues within RNA poly(A) tails., Nat Commun, 10, 5292.

联系我们

如果您不想再收到此邮件，请点击退订，转发请点击这里，投诉请点击这里