Spektrometrie

[Frida Kosofsky]

Tandemovhmotnostn spektrometrie, zkrceně MS/MS nebo MS2 je druh instrumentln analzy, při kterm se propojuje vce hmotnostnch spektrometrů za čelem přidn dalšho reakčnho kroku a zlepšen parametrů analzy chemickch vzorků.[1] Často se použv k analze biomolekul, jako jsou blkoviny a peptidy.

Molekuly vzorku se ionizuj a prvn spektrometr (MS1) odděl vznikl ionty podle jejich poměru hmotnosti a nboje (značenho m/z nebo m/Q). Ionty o určitch hodnotch m/z-ratio jsou odděleny a nsledně přeměněny na fragmentovan ionty, napřklad sržkami indukovanou disociac, reakcemi iontů s molekulami nebo fotodisociac. Tyto fragmenty pot vstupuj do druhho hmotnostnho spektrometru (MS2), kde se opět rozděl podle m/z a jsou detekovny. Fragmentačn krok umožňuje identifikaci a oddělen iontů s velmi podobnmi hodnotami m/z v běžnch hmotnostnch spektrometrech.

K druhům tandemov hmotnostn spektrometrie na zkladě uspořdn patř napřklad trojit kvadruplov hmotnostn spektrometr (qqq), čtyřnsobn spektrometr doby letu (Q-tof) a hybridn hmotnostn spektrometr.

Trojit kvadruplov hmotnostn spektrometry použvaj prvn a třet kvadrupl jako hmotnostn filtry. Při průchodu analytů druhm kvadruplem dochz k fragmentaci sržkami jejich molekul s plynem. Toto uspořdn je nejběžnějš ve farmaceutickm průmyslu.

Kvadruplov spektrometry doby letu (Q-tof) spojuj hmotnostn spektrometrii doby letu a kvadruplov hmotnostn spektrometry, čmž se dosahuje vysok hmotnostn přesnosti u vytvořench iontů a využitelnosti fragmentačnch experimentů. Poměr (m/z) je zde určovn měřenm doby letu iontů.

Při tandemov hmotnostn spektrometrii v prostoru jsou separačn zařzen fyzicky oddělen, i když jsou jednotliv prvky stle propojen, aby bylo zachovno vysok vakuum. Těmito prvky mohou bt sektory, kvadruply nebo spektrometry doby letu. Je-li použito vce kvadruplovch spektrometrů, tak mohou sloužit jako hmotnostn analyztory i sržkov komory.

U tandemov hmotnostn spektrometrie v čase separace probh společně se zachytvnm iontů na stejnm mstě, přičemž dojde k několika separačnm krokům. Použvaj se napřklad kvadruplov iontov pasti a iontov cyklotronov rezonance s Fourierovou transformac (FTICR).[2] Analza se může skldat z několika kroků, pak se někdy použvaj zkratky ve tvaru MSn;[3] napřklad MS3 označuje třfzovou separaci.

Přstroje na tandemovou hmotnostn spektrometrii v čase nevyužvaj nže popsan režimy, ale obvykle zskvaj data skenovnm prekurzorů iontů v rmci celho spektra. Každ uspořdn zařzen představuje jedinečn způsob analzy.

Při provděn tandemov MS v prostoru existuje několik režimů provozu soustavy. Existuje řada různch druhů seřazen přstrojů a každ m sv využit a poskytuje jin daje. Tandemov hmotnostn spektrometrie v prostoru spojuje dva přstroje, kter měř spektra ve stejnm rozsahu, ovšem s kontrolovanou tvorbou fragmentů, zatmco tandemov MS v čase využv iontov pasti.

V detekci produktovch iontů se třd ionty prekurzoru v prvnm spektrometru, což dovoluje třděn fragmentů a dalšch vzniklch čstic ve druhm hmotnostnm analyztoru a detekci detektorem umstěnm za druhm hmotnostnm analyztorem. Tato metoda se použv k identifikaci procesů využvanch k určen množstv ltek pomoc tandemov hmotnostn spektrometrie.

Při zkoumn ztrty neutrlnch čstic zkoum prvn hmotnostn analyztor všechny čstice. Druh analyztor pak zkoum čstice s určitm posunem oproti prvnmu analyztoru.[4] Tento posun odpovd ztrtě neutrln čstice. Při zkoumn konstantn ztrty se sleduj všechny prekurzory, u kterch dochz k oddělen konkrtn čstice. Oba hmotnostn analyztory neprovděj detekci současně, ale s určitm posunem odpovdajcm hmotnosti přslušn neutrln čstice. Podobně jako u zkoumn prekurzorovch iontů se tento postup d použt k selektivn identifikaci strukturně podobnch sloučenin.

Fragmentace iontů v plynn fzi je pro tandemovou hmotnostn spektrometrii důležit; dochz k n v různch fzch analzy. K fragmentaci iontů se použvaj různ postupy, kter se mohou lišit způsoby fragmentace a tedy i druhem informac o struktuře a složen molekul, kter je možn pomoc nich zskat.

Často je samotn ionizace dostatečně siln na to, aby se fragmenty vytvřely už ve hmotnostnm spektrometru. Pokud ionty produktu zůstanou v nerovnovžnm stavu dostatečně dlouhou dobu před autodisociac, pak se jedn o metastabiln fragmentaci.[6] Fragmentaci ve zdroji lze v tandemov hmotnostn spektrometrii použt prostřednictvm metody EISA, při nž fragmentace přmo odpovd datům z tandemov hmotnostn spektrometrie.[7]

EISA umožňuje zskat data o fragmentaci u MS1 hmotnostnch analyztorů, jako jsou přstroje založen na době letu a jednoduch kvadruplov zařzen. Fragmentace uvnitř zdroje se často použv k umožněn dvoukrokov fragmentace u pseudo MS3 experimentů.[9]

Postzdrojov fragmentace se v tandemov hmotnostn spektrometrii použv nejčastěji. Energie se dodv iontům, kter jsou již většinou vibračně excitovan sržkami s neutrlnmi atomy nebo molekulami, absorpc zřen, nebo přenosy či zchyty elektronů ionty s vcensobnmi nboji. Sržkami indukovan disociace, tak někdy nazvan aktivovan disociace, spočv ve sržkch iontů s neutrlnmi čsticemi v plynn fzi a nsledn disociaci iontů.[10][11]

kde se ion AB+ srž s neutrln čstic M a pot se rozpad. S ohledem na různ konfigurace přstroje se objevuj dva hlavn typy disociace: (i) paprskov (kdy jsou ionty prekurzoru fragmentovny během letu)[12] a (ii) iontov past (při kter jsou ionty prekurzoru nejprve zachyceny, a až pot fragmentovny).[13][14]

Třetm, novějšm, typem sržkami indukovan disociace je sržkov disociace při vyššch energich (HCD). Jedn se o techniku specifickou pro orbitrapov hmotnostn spektrometry, u nichž fragmentace probh mimo iontovou past,[15][16] proces probh v HCD komorch (v některch přstrojch nazvanch "iontov směrovac multiply").[17]

HCD je fragmentačn metoda typu iontov pasti, kter m určit vlastnosti odpovdajc paprskovmu typu.[18][19] Existuj volně dostupn databze pro tandemovou hmotnostn spektrometrii, jako napřklad METLIN, zahrnujc 850 000 molekulovch standardů s přslušnmi experimentlnmi CID MS/MS daty);[20] obvykle se využvaj k identifikaci menšch molekul.

Podobně jako u disociace zchytem elektronu ETD vyvolv fragmentaci kationtů (napřklad peptidovch nebo blkovinovch) přenšenm elektronů na tyto čstice. Tuto metodu objevili Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka a Jarrod Marto na Univerzitě ve Virginii.[24]

ETD způsobuje štěpen nhodně podl hlavnho peptidovho řetězce (za vzniku c- a z iontů), zatmco vedlejš řetězce a modifikace, jako je fosforylace, j zasaženy nejsou. Technika dobře funguje pouze u iontů s většmi nboji (z>2), ovšem podobně jako u sržkami vyvolvan disociace (CID) lze pomoc ETD fragmentovat i větš peptidy až blkoviny, což m využit v proteomice. Podobně jako ECD je ETD dobře využitelnou metodou u peptidů s posttranslačnmi modifikacemi, jako je fosforylace.[26]

Disociace přenosem elektronů a disociace sržkami s vyšš energi (EThcD) je kombinac ETD a HCD, kde peptidov prekurzor vstupuje do iontovo/iontovch reakc s anionty fluoranthenu v linern iontov pasti, kter vytvř c- a z-ionty.[22][27]

V druhm kroku se použije HCD fragmentace na všechny ionty vytvořen pomoc ETD, čmž vzniknou b- a y ionty, jež jsou nakonec analyzovny v orbitrapovm analyztoru.[15] Při tto metodě se použv dvoj fragmentace, protože se tvoř velk množstv iontů a MS/MS spektra jsou tak bohat na data využiteln při sekvencovn peptidů a hledn posttranslačnch modifikac.[28]

Jedn se o protipl disociace zchytem elektronů. Zporně nabit ionty se aktivuj ozřenm elektrony se středně vysokmi kinetickmi energiemi. Dojde tak k odštěpen elektronů z původn iontov molekuly a v důsledku rekombinace k disociaci.

Reakce kladně nabitch peptidů s kationtovmi reaktanty,[31] znm jako disociace přenosem nboje (CTD),[32] byla uznna za alternativn metodu vysokoenergetick fragmentace peptidovch iontů s nzkmi nboji (+1 nebo +2). Navržen mechanismus CTD s využitm heliovch kationtů jako reaktantů vypad takto:

Fotony infračervenho zřen při absorbovn v dostatečnm množstv zahřvaj ionty a způsobuj jejich disociaci. Tento proces se nazv vcefotonov infračerven disociace (IRMPD) a obvykle se provd pomoc CO2 laseru a hmotnostnho spektrometru s iontovou past, napřklad FTMS.[34]

Tento postup se podob vcefotonov infračerven disociaci, při kter se ovšem infračerven zřen zskv jinm způsobem.[11] Obvykle se použv společně s cyklotronovou rezonanc iontů s Fourierovou transformac.

SID lze použt k fragmentaci mnoha různch iontů. Původně se tato metoda běžně použvala pouze u iontů s nzkmi molekulovmi hmotnostmi a s jednotkovmi nboji, protože metody ionizace a hmotnostn analzy ještě nebyly dostatečně vyvinut ke zkoumn iontů s vysokm m/z. Postupně se však začaly použvat jednovrstv povrchy SAM tvořen CF3(CF2)10CH2CH2S na vrstvě zlata. SAM jsou pro tento čel vhodn, protože maj vysok efektivn hmotnosti při sržkch s ionty a navc jsou tvořeny nereaktivnmi fluorouhlovodkovmi řetězci, kter vrazně snižuj energie dopadajcch iontů. Fluorouhlovodky taktž omezuj přenos elektronů z povrchu kovu na ionty.[39]

Možnost SID vytvřet stabiln subkomplexy, kter poskytuj využiteln informace o struktuře, nelze doshnout ždnou jinou znmou technikou. Dky tomu, že jsou tyto komplexy stabiln a zachovvaj rozdělen nboje na fragmentu, tak lze zskat jedinečn spektra s komplexy majcmi užš rozdělen m/z. Produkty tto metody a jejich energie odpovdaj vždy sle a topologii komplexu. Jedinečn vzory disociace umožňuj zjistit kvaternrn struktury. Symetrick rozdělen nboje a disociace jsou typick pro SID a maj za nsledek spektra odlišn od ostatnch disociačnch jednotek.[39]

SID lze využt i ve ihmotnostn spektrometrii iontov pohyblivosti (IM-MS). Objevuje se zde trojice metod, pro určen topologie, propojen podjednotek, a rozvinovn struktury. Analza rozvinovn struktury je nejčastějšm způsobem využit SID. U hmotnostn spektrometrie iontov pohyblivosti (IM-MS) SID slouž k disociaci zdrojů aktivovanch prekurzorů tř různch typů proteinovch komplexů: C-reaktivnho proteinu (CRP), transthyretinu (TTR) and konkanavalinu A (Con A). Při analze mry rozvinovn SID zobrazuje strukturu prekurzorovch iontů před sržkou s povrchem. IM-MS využv SID jako způsob potvrzen struktury každ podjednotky.[40]

3a8082e126