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METODOS INSTRUMENTALES EN QUIMICA CLINICA
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Laser: El rayo láser es un sistema de amplificación de la luz que produce rayos coincidentes de enorme intensidad, los cuales presentan ondas de igual frecuencia. La palabra LASER es la sigla (en ingles): Ligth Amplification by Stimulated Emission of Radiation, que traducido al español es: amplificación de la luz por emisión estimulada de radiación | Principio: El átomo está integrado por un núcleo, formado por un conjunto de protones y neutrones, y por una serie de electrones ubicados a determinada distancia, alrededor del núcleo. Electrones, protones y neutrones son las tres partículas básicas. Los electrones poseen una masa muy pequeña y carga negativa. Por su parte, protones y neutrones tienen aproximadamente la misma masa, pero mientras los primeros poseen carga eléctrica positiva, los neutrones carecen de carga. Los electrones del átomo, cuya energía depende de su distancia al núcleo, pueden encontrarse en estado: Excitado con una energía superior a la normal o en reposo. En el estado excitado, el electrón almacena una determinada proporción de energía. | Utilizacion: Medicina: Operaciones sin sangre, tratamientos quirúrgicos, ayudas a la cicatrización de heridas, tratamientos de piedras en el riñón, operaciones de vista, operaciones odontológicas. Industria: Cortado, guiado de maquinaria y robots de fabricación, mediciones de distancias precisas mediante láser. Ingeniería Civil: Guiado de máquinas para túneles, diferentes aplicaciones en la topografía como mediciones de distancias. Investigación: Espectroscopía Desarrollos en productos comerciales: Impresoras láser, CD, lectores de código de barras, punteros láser, termómetros, aplicaciones en iluminación de espectáculos. Tratamientos cosméticos y cirugía estética: Tratamientos de Acné, celulitis, tratamiento de las estrías, depilación. |
Espectroscopia de Emisión de Plasma Fundamento: Durante el proceso de desexcitación de los átomos neutros e iones en el interior de un plasma, se producen las emisiones de radiación electromagnética en la zona del UV-visible. Estas radiaciones, características de cada elemento, se separan en función de su longitud de onda y finalmente se mide su intensidad. La selección de la longitud de onda nos permite determinar el metal cualitativamente, mientras que la intensidad de la radiación emitida nos proporcionará la información para poder cuantificarlo. | Componentes del Instrumento El plasma: que deberá reunir ciertas condiciones de temperatura, confinamiento, etc. El generador eléctrico: que aportará la energía externa al plasma que la disipará en forma térmica y radiante. El sistema de introducción de la muestra: que deberá permitir un eficaz aporte de la muestra al conjunto. El sistema de alimentación de gas: que asegure el funcionamiento del plasma, el transporte de la muestra, la formación del aerosol con la muestra, la purga del sistema óptico y la refrigeración de la antorcha. El sistema óptico: que permitirá analizar el espectro emitido por el plasma. El sistema de tratamiento de la señal: que permitirá análisis cualitativo y cuantitativo a partir de las radiaciones emitidas. | Aplicaciones analíticas Las altas temperaturas alcanzadas aumentan el número de elementos que se pueden determinar, tanto cualitativa como cuantitativamente, ya que la temperatura se puede estabilizar. Presenta una gran versatilidad y exactitud, reproductibilidad permitiendo trabajar con muy pequeños volúmenes de muestra, rebajando considerablemente los límites de detección. Se emplea en el análisis de metales, líquidos biológicos, usándose junto a la cromatografía de gases en la determinación del plomo en sangre, arsénico, antimonio, plomo en aire y agua. |
Espectroscopia de Absorción Atómica Fundamento: Técnica basada en la medida de la radiación absorbida por los átomos libres en su estado fundamental. En el proceso el átomo pasa de un estado energético inf, a otro sup. Para esto se necesita suministrar energía de una long. de onda especifica del elemento que se quiere excitar. La fuente de radiación consiste en una lámpara que contiene un cátodo del elemento que se va a analizar. Este cátodo emite radiaciones típicas del elemento. Al hacer incidir esta radiación a través de la muestra , los átomos absorberán parte de la energía emitida . La diferencia entre la energía incidente y la transmitida se recoge en un detector, permitiendo realizar una determinación cuantitativa del elemento. | Instrumentación FUENTE DE LUZ: lámpara de cátodo, láser. TIPO DE ATOMIZARDOR:A.a la flama (contiene quemador) , A. Electrotérmico. MONOCROMADOR DETECTOR | Aplicaciones: AGRICULTURA ALIMENTOS: análisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales, alimentos. BIOLOGIA Y CLINICA: determinación de tóxicos en orina, sangre, heces, leche materna. AGUAS : análisis de aguas continentales, potables, vértigo, salmuera y aguas de mar. |
Espectroscopia de Fluorescencia Atómica Fundamento: La fluorescencia es una forma de emisión por excitación por radiación electromagnética. Fuente es perpendicular al eje formado por atomizador, monocromador y detector. Lo que mido es la radiación emitida por los átomos el volver al estado fundamental. Este método usa un quemador con una salida de incineración redonda. La llama se usa para solvatar y atomizar la muestra, y una lámpara emite luz a una longitud de onda específica en la llama para excitar los átomos de analito. Los átomos de ciertos elementos pueden entonces fluorescer, emitiendo luz en diferentes direcciones | Instrumentación Fuente. De mayor intensidad que en absorción. Las lamparas de cátodo hueco son insuficientes por lo que se utilizan las lamparas de descarga sin electrodo. Se fabrican es tubos de cuarzo que contiene un compuesto. Este compuesto va a depender de la longitud de onda a la que queramos emitir. Se hace el vacío en el tubo con un gas noble. Se somete al tubo a un campo de microondas, el gas noble se ioniza y los electrones liberados excitan al compuesto y al volver este a su estado fundamental va a emitir radiación, cuya longitud de onda va a quedar determinada por el compuesto que hallamos puesto. Atomizadores. Pueden ser de llama o por calentamiento electrotérmico. En llama se utiliza un mechero separador que quita el manto externo a la llama. Por calentamiento electrotermico se utiliza una especie de horno de grafito con la diferencia que consigue que la fuente sea perpendicular al eje del atomizador, monocromador y detector. Monocromadores. Si se trabajo con fuentes de línea no se requiere alto grado de monocromación, ya que la posición del aparto(fuente perpendicular) ya hace las labores. Sin embargo si trabajamos con fuente de continuo si necesitamos un monocromador. | Aplicaciones: Emisión Visible. Se aplica para la detección de alcalinos y alcalinoterreos. Absorción Ultravioleta. Para los metales de transición. Ultravioleta lejano. Semimetales. El problema es que el aire o la propia llama también absorben. Un método para su detección es la generación de los hidruros correspondientes. Da sensibilidad de partes por millón. El resto de los elementos no pueden detectarse por aplicación directa de las técnicas espectroscopicas. Sí mediante métodos indirectos. La emisión y absorción con llama nos dan una sensibilidad de partes por millón. La absorción atómica por calentamiento electrotérmico y el método indirecto de generación de hidruros correspondientes dan una sensibilidad de partes por millón. |
Espectroscopia de Rayos X Es un nombre genérico que abarca todas aquellas técnicas espectroscópicas utilizadas para determinar la estructura electrónica de los materiales mediante excitación por rayos X. La espectroscopia de rayos X tiene una amplia gama de aplicaciones, en especial en la determinación de estructuras cristalinas y muestras sólidas.Los rayos X son un tipo de radiación electromagnética con una energía muy superior a la radiación ultravioleta que permite su absorción por los electrones de core. Los rayos X son especialmente capaces de penetrar estructuras cristalinas: su longitud de onda, de un orden de magnitud igual al de las distancias interatómicas, hace que se difracten, produciendo los patrones de difracción del cristal. | Técnicas espectroscópicas de rayos X La absorción, difracción, emisión, fluorescencia y dispersión de los rayos X se utilizan en muchas técnicas espectroscópicas que nos aportan información sobre la estructura y la composición de la materia:
| Aplicaciones Son muy útiles para examinar objetos, por ejemplo piezas metálicas, sin destruirlos. Las imágenes de rayos X en placas fotográficas muestran la existencia de fallas. Tecnología e Industria Soldadura mal hecha por falta de penetración (línea negra) Imagen radiográfica de una soldadura bien hecha Los rayos X ultra blandos se emplean para determinar la autenticidad de obras de arte y para restaurar cuadros. F otografía de una pintura y su radiografía mostrando dos pinturas superpuestas en el mismo lienzo Obras de Arte Gracias a los telescopios de rayos x, los científicos pueden estudiar los fenómenos de galaxias a millones de años luz de distancia mediante la interpretación de fotografías de Rayos X. |
Espectroscopia Infrarroja Espectroscopia infrarroja (Espectroscopia IR) es la rama de la espectroscopia que trata con la parte infrarroja del espectro electromagnético. Esta cubre un conjunto de técnicas, siendo la más común una forma de espectroscopia de absorción. Así como otras técnicas espectroscópicas, puede usarse para identificar un compuesto e investigar la composición de una muestra. Esta se puede dividir según el tipo de la radiación que se analiza, en: Espectroscopia del Infrarrojo cercano Espectroscopia del infrarrojo medio Espectroscopia del infrarrojo lejano | Fundamentos La espectroscopia infrarroja se basa en el hecho de que las moléculas tienen frecuencias a las cuales rotan y vibran, es decir, los movimientos de rotación y vibración moleculares tienen niveles de energía discretos (modos normales vibracionales). Las frecuencias resonantes o frecuencias vibracionales son determinados por la forma de las superficies de energía potencial molecular, las masas de los átomos y, eventualmente por el acoplamiento vibrónico asociado. Para que un modo vibracional en una molécula sea activa al IR, debe estar asociada con cambios en el dipolo permanente. En particular, en las aproximaciones de Born-Oppenheimer y armónicas, i.e. cuando el Hamiltoniano molecular correspondiente al estado electrónico puede ser aproximado por un oscilador armónico en la vecindad de la geometría molecular de equilibrio, las frecuencias resonantes son determinadas por los modos normales correspondientes a la superficie de energía potencial del estado electrónico de la molécula. Sin embargo, las frecuencias resonantes pueden estar en una primera aproximación relacionadas con la fuerza del enlace, y la masa de los átomos a cada lado del mismo. Así, la frecuencia de las vibraciones pueden ser asociadas con un tipo particular de enlace. | La espectroscopia infrarroja es ampliamente usada en investigación y en la industria como una simple y confiable práctica para realizar mediciones, control de calidad y mediciones dinámicas. Los instrumentos son en la actualidad pequeños y pueden transportarse fácilmente, incluso en su uso para ensayos en terreno. Con una tecnología de filtración y manipulación de resultados en agua, las muestras en solución pueden ser medidas con precisión (el agua produce una absorbancia amplia a lo largo del rango de interés, volviendo al espectro ilegible sin este tratamiento computacional). Algunas máquinas indican automáticamente cuál es la sustancia que está siendo medida a partir de miles de espectros de referencia almacenados. Al medir a una frecuencia específica a lo largo del tiempo, se pueden medir cambios en el carácter o la cantidad de un enlace particular. Esto es especialmente útil para medir el grado de polimerización en la manufactura de polímeros. Las máquinas modernas de investigación pueden tomar mediciones infrarrojas a lo largo de todo el rango de interés con una frecuencia de hasta 32 veces por segundo. Esto puede realizarse mientras se realizan mediciones simultáneas usando otras técnicas. Esto hace que la observación de reacciones químicas y procesos sea más rápida y precisa. |
Fluorescencia Molecular La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en el que los átomos o las moléculas son excitados por absorción de la radiación electromagnética. Las especies que han sido excitadas se relajan luego hacia el estado fundamental, liberando el exceso de energía en forma de fotones. La principal ventaja de la fluorescencia molecular es su elevada sensibilidad, que suele ser de uno a tres ordenes de magnitud superior a la de la espectroscopia de absorción, con este método se han detectado moléculas únicas de especies seleccionadas y en condiciones controladas. Otra de sus ventajas es el amplio intervalo de concentración lineal, el cual es significativamente mayor que el que se encuentra en la espectroscopia de absorción. | Fundamento Para medir esta propiedad, la muestra se excita a la longitud de absorción, o longitud de onda de excitación, y se mide la emisión a una longitud de onda mayor, llamada longitud de fluorescencia o emisión. Por ejemplo, la forma reducida de la coenzima dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) puede absorber radiación a 340nm. La molécula fluoresce con una emisión máxima a 465nm. Esta fluorescencia se mide normalmente en ángulo recto al rayo incidente, así se evita medir la radiación incidente. La emisión que tiene una vida mas corta se conoce como fluorescencia, mientras la luminiscencia que permanece por más tiempo se llama fosforescencia. | Todos los equipos para análisis por fluorescencia funcionan con el sistema de configuración general. Si los dos selectores de longitud de onda son filtros, el equipo se llama fluoròmetro, y si estos son monocromadores, se dice que el instrumento es un espectrofluoròmetro. En algunos instrumentos se combinan estas dos características, utilizan un filtro de excitación junto con un monocromador de emisión. Los equipos de fluorescencia también pueden llevar un sistema de doble haz para compensar los cambios en la energía de la fuente de radiación debidos al uso y al cambio de longitud de onda. Los equipos que pueden corregir la distribución espectral de la fuente de radiación se conocen como espectrofluoròmetros rectificadores. Las aplicaciones de los métodos de fluorescencia para resolver problemas orgánicos y bioquímicas son impresionantes. Entre los numerosos compuestos que pueden determinarse por fluorescencia se encuentran los aminoácidos, las proteínas, las coenzimas, las vitaminas, los ácidos nucleicos, los alcaloides, las porfirinas, los esteroides, los flavonoides y muchos metabolitos. |
Quimioluminiscencia Fundamentos La Quimioluminiscencia es definida como la producción química de la luz, es decir luz emitida a partir de una reacción química. La QL es la emisión de radiación electromagnética, normalmente en la región del visible o infrarrojo cercano, producida por una reacción química. Para que se dé la QL es necesario que la reacción produzca un exceso de energía, lo cual es bastante frecuente sobretodo en reacciones rédox. | comprenden los siguientes pasos: 1. Reacción química inicial que proporciona el intermedio o producto. 2. Conversión del exceso de energía química en excitación electrónica de este intermedio. 3. Transferencia de energía en el caso de la QL indirecta. 4. Emisión de la luz por parte de las especies excitadas. | Aplicaciones
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Bioluminiscencia Se conoce como bioluminiscencia a la producción de luz de ciertos organismos vivos. Se fundamenta en la rx al combinar atp de los microorganismo o se residuos de alimentos con la enzima luciferaza. | Fundamento Tendencias actuales y perspectivas | Peroxioxalatos - Mediante formación de derivados: aminoácidos, aminas, esteroides,.. - Analitos fluorescentes 2. Luminol - Metales de transición - Ligandos (catecolaminas, aminoácidos y proteínas) - Especies derivatizadas precolumna con luminol y derivados. |
Espectroscopia Fotoacústica Esta espectroscopia se desarrollo en 1970, y proporciona un medio para la obtención de espectros de absorción ultravioleta y visibles de liquidos turbios, semisólidos y solidos. Estaecnica supuso un gran avance ya que hasta entonces era muy difícil debido a problemas que aparecia con la dispersión y reflexión de la radiación. | Fundamento La técnica se basa en el efecto de absorción de la luz, lo podemos ver cuando un gas que se encuentra en una celda es irradiado con un haz de radiación intermitente de una longitud de onda que absorbe el gas, esto produce una serie de fluctuaciones regulares de la presión del gas en el interior de la cámara. Si la intermitencia corresponde al intervalo de la frecuencia acústica los pulsos de presión pueden ser detectados por un micrófono. La muestra de pone en una celda cerrada que contiene aire u otro gas que no absorbe la radiación y un micrófono sensible. | El efecto fotoacustico se observa cuando la radiación es absorbida por la muestra, la potencia del sonido que se obtiene esta relacionada con el grado de absorción. Este método tiene la ventaja de que la radiación dispersada o reflejada por la muestra no tiene efecto en el micrófono. Existen instrumentos de haz simple y de doble haz, que en general tienen la fuente de radiación, el monocromador, la celda foto acústica, amplificadores y el analizador. La espectroscopia foto acústica permite estudios de la sangre sin necesidad de una separación preliminar de las moléculas que la componen. Otras aplicaciones del método incluyen el estudio de minerales, algas marinas, tejidos de animales, baños de superficies, superficies catalíticas, semiconductores, etc. |
Espectroscopia de resonancia magnética nuclear | Fundamento Instrumentación Aplicaciones | |
Microscopia Electrónica La microscopía electrónica de barrido permite el estudio de superficies celulares. La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra con un haz electrónico ultrafino. Las señales generadas se recolectan, amplifican y captan en un tubo de rayos catódicos. Se utiliza en forma rutinaria en el estudio de enfermedades del tallo piloso. En estas condiciones hay anomalías estructurales y de superficie de los pelos, que pueden identificarse fácilmente con esta técnica. De esta forma, es posible incluso establecer un pronóstico de reversibilidad de las alteraciones utilizando esta técnica. | En el microscopio electrónico, un haz de electrones incide sobre una muestra y de la interacción de estos electrones con los átomos de la misma, surgen señales que son captadas por algún detector o bien, proyectadas directamente sobre una pantalla. Dentro de la familia de microscopios electrónicos, se encuentran el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes características de una muestra. El SEM provee información sobre morfología y características de la superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultraestructurales. Un gran avance se ha alcanzado con la incorporación de técnicas de procesamiento de imágenes para revelar detalles específicos de interés, algunos de ellos ligados a la ultraestructura de la muestra. | Mediante el microscopio electrónico de transmisión podemos estudiar la ultra estructura de un material orgánico o inorgánico. Para esto, existen diferentes formas de operación que posibilitan el estudio de una característica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales no- biológicos y biológicos podemos nombrar :
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Citometría de flujo La Citometria de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. | Equipo Instrumental Componentes •Sistema de Fluidos •Sistema Óptico: Fuente de luz Separación espectral •Sistema Electrónico: Control mecánico, de luz y detectores Colección y análisis de pulsos •Sistema Informático: Análisis y presentación de datos | APLICACIONES Hematología Inmunología Patología Transplantes Farmacología Biología Toxicología Microbiología Parasitología Citogenética Virología Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidiade ADN y Ciclo Celular Estudio de macrófagos intestinales (EII). Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio, fagocitosis, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.) Cuantificación de moléculas Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudios de Función Plaquetaria Estudios de Resistencia a Drogas Estudio de Citokinas Intracelulares |
Ultracentrifugación Es sedimentar al fondo del tubo, el componente de mayor S Se usa para separar una mezcla compleja en los distintos componentes en base a sus diferencias de tamaño y/o masa Diferencias grandes de S para lograr separación En general se realiza en sistema homogéneo, pero se puede hacer a través de gradiente de densidad | Aplicaciones: experimentos de velocidad y equilibrio de sedimentación, para la determinación de parámetros moleculares y para juzgar el grado de pureza de proteínas y otras macromoléculas en disolución. Es posible el cálculo de coeficientes de sedimentación, masas moleculares, densidades de flotación y coeficientes de difusión. Muy útil en estudios de asociación de macromoléculas y en la detección de los cambios conformacionales que repercutan en las propiedades hidrodinámicas de una molécula. | |
Técnicas Radioquímicas FUNDAMENTO Estos métodos se basan en la detección de radiactividad en forma de partículas alfa y beta y de rayos gamma, que se originan en las desintegraciones nucleares. La radiactividad puede generarse en la muestra bombardeándola con neutrones. Este procedimiento, llamado análisis por activación de neutrones, se utiliza en la industria para identificar ciertos metales de una muestra. El análisis por activación de neutrones tiene la ventaja de ser rápido y automatizado, además de no destruir la muestra. | TIPO DE DESINTEGRACION
| Aplicaciones Análisis de dilución isotópica consiste en la valoración cuantitativa de un elemento de una muestra, a la que se le añade una cantidad conocida (mo)de una sustacia que contenga radioisótopos del elemento en cuestión Análisis de activación se basa en el hecho de que muchos elementos químicos estables pueden convertirse en radiactivos por bom-bardeo con partículas energéticas , como protones, deuterones partículas alfa o neutrones Radioinmunoanálisis es un método de valoración cuantitativa de sustancias pre-sentes en muestras biológicas sangre orina como a la investigación bioquímica y valo-ración de farmacos Aplicaciones en medicina Tratamiento por radiación externa. La interacción de las radia-ciones con la materia orgánica conduce en mu-chos casos a la detención del crecimiento de esta o a su destrucción ej. Destruir tumores. Radiofármacos. Son sustancias marcadas destinadas a administrarse a un paciente con finalidades diversas lo que nos hace distinguir entre varios grupos: terapéuticos y de diagnostico |
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