酶联免疫吸附分析（ELISA）技术使用须知
Edikar
(张宏、李振甫)
一、背景介绍
当前,尽管实验室内已有众多方法可用于确定抗体产生的检测,
但应用最多的仍是酶免疫法(EIA)。在常用的微量免疫学测定方法，如免疫荧光及放射免疫技术的基础上，1966年美国的科学家开始介绍酶免疫技术。由于酶亦可像荧光素或放射性核素一样作为标记物用于免疫测定,而且,
酶代替荧光素或放射性核素作标记物，可避免荧光免疫技术使用特殊装备,如荧光显微镜等,也不需要放射免疫技术的防护措施，因此无放射性损伤之虑。1971年,建立了酶免疫测定法，命名为酶联免疫吸附测定法(Enzyme
Linked Immunosorbent
Assay,ELISA)。其兼有免疫荧光及放射免疫测定的优点,而克服了这两个方法的一些缺点。此外，酶标试剂稳定，有效期长，可进行定性或定量测定,灵敏度近似于放射免疫试验，目前己广泛用于医学生物学领域，方法本身也不断得到改进与完善。
二、实验过程
酶免疫技术一般均由两部分组成，即一次或数次免疫学反应和一次酶促反应。抗原-抗体发生特异结合后，加入酶标价的第二抗体（酶结合物在此起抗抗体的作用），然后加入酶的底物，在酶催化下发生水解、氧化或其他反应，生成有色产物。酶结合物发挥酶学活性，此活性与产物呈现的颜色深浅成正比，从而反映出被测定抗原或抗体的量。
三、实验条件及注意事项
（一）实验条件
1、固相载体
可作为固相载体的物质很多，如:纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。可以各种形式出现:
试管、微量反应板凹孔、小珠等。最常用的聚苯乙烯板（96孔板），其对蛋白质的吸附性最好。
2、封闭
以无关蛋白占据载体上未被包被的空隙，常用的封闭液是1%牛血清白蛋白或10%小牛血清。
3、待测样品
稀释度要合适,浓度太大会发生非特异性吸附,造成假阳性,过分稀释会影响抗原-抗体之间的免疫学反应。选择最适稀释度的方法是作系列稀释，在试验体系中取光密度在1.0左右的稀释度为宜。
4、酶结合物
酶结合物即酶标记的免疫反应物(抗体或抗原),是通过适当的化学反应或免疫学反应，让抗体或抗原分子以共价键或其他形式与酶蛋白分子相偶合,形成酶标抗体或酶标抗原。该结合物保留原先的免疫学活性和酶学活性，所以既有抗原-抗体反应的特异性，又有酶促反应的生物放大作用。制备高质量的酶结合物，在免疫酶技术中是至关重要的。
(1)被标记物 ①
抗体被酶标记的多数是蛋白质，实验室常标记的是抗体。对于酶标抗体的要求应是高纯度、高活性，以保证制备的酶标抗体与相应的抗原之间的免疫反应是特异的；②亲和素/生物素复合物(Avidin-Biotin
Complex，ABC)亲和素Avidin又称卵白蛋白，是一种分子量为68KD的糖蛋白。它与生物素Biotin(又称维生素H)之间会发生非共价性反应，具有高度亲和力。这种亲和力要超过抗体对大多数抗原亲和力100万倍。所以，Avidin对Biotin的结合是不可逆的。同时,
Avidin有4个结合位点可与Biotin结合。因此,在免疫酶技术中可利用Avidin与Biotin之间的这种反应特性，以Biotin标记抗体或与酶结合,再通过Avidin-Biotin的架桥把酶与抗体连接起来,以提高检测方法的敏感度。
(2)酶
免疫酶技术具有高度敏感性的关键，是因为选用了有生物放大作用的酶作为标记物。常用的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及半乳糖苷酶等。在免疫酶技术中使用的酶应符合以下一些条件：纯度高、催化反应转化速率高、有足够的偶联用的标记基团、化学性质稳定以及纯化方便、价格低廉。国内实验室中常用的酶是辣根过氧化物酶，分子量为40KD，具有稳定的化学性质，63℃加热15分钟不失活，pH3.5-12不变性，比活性高、易分离提纯、廉价、灵敏。该酶有一个纯度值
RZ（即RZ=A403mn/A275mn），RZ越高表示酶的纯度越高,值低则纯度低,即非酶蛋白多。纯酶的RZ值在3.0以上，最高可达3.4。
(3)酶标记物的制备与纯化
通过免疫学反应或化学反应，使酶与抗体或其他抗原、半抗原物质结合的过程，称为酶的标记或交联。结合的产物称为酶结合物或酶标记物。酶与抗体进行化学交联后，一般以凝胶过滤进行纯化。若用辣根过氧化物酶标记抗体，经
Sephadex
G-150凝胶柱，收集流出液，分别测A275mn与A403mn，取最高峰处集中,按1%浓度加入牛血清白蛋白,过滤除菌,低温保存。
(4)标记物的质量与鉴定
酶结合物是具有双重功能的生物大分子,它既参与高度特异的免疫反应,又起生物催化放大作用。酶结合物的质量直接关系到免疫酶技术中的定性、定位和定量结果。酶结合物的质量取决于交联用的酶的批号和抗体的质量。对于各种交联方法制备的酶结合物质量鉴定，通常要测量与计算酶结合物中酶的量、抗体含量以及酶与抗体的克分子比值,还需测定酶结合物的免疫活性和酶活性等。
5、底物
底物一般都是致突变的有毒物质，所以称量、配制时应注意防护。
6、洗涤
操作流程中要经数次洗涤，洗涤的效果直接关系到ELISA检测结果，常用的是含0.05%吐温20的PBS,或仅用PBS。
(二)注意事项
酶联免疫技术的试剂标准化问题尚未完全解决，如孵育过程的时间、温度、洗涤液的类别及洗涤次数等，都是影响最后测定的因素。为使实验得到满意的结果，在操作过程中应做到以下三点。
1、每次实验每块反应板均必须设阳性和阴性对照；
2、封闭要完全；
3、洗涤要彻底。
四、服务项目
1、 技术咨询及协助实验设计。
2、 提供抗原、抗体纯化方法和酶标记方法。
3、
有偿提供（只收取成本费）亲和层析纯化的：羊抗人IgG、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、兔抗人IgG、兔抗鼠IgG。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、羊抗人IgG及羊抗兔IgG（效价1:1000-1:2000）。
4、 可进行405nm\450nm\490nm\570nm\650nm波长的测定。
五、价格及联系方式
价格：使用设备暂不收费
联系人 ： 张宏、李振甫
联系方法：电话66179255/66163181
地址：北京肿瘤防治研究所中心实验室（307室）