Skip to first unread message
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 2:55:24 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
googlézok anyagokat, hátha találtok benne hasznosat. mindez a legtágabb levlistára megy, hogy minél többen hozzá tudjanak szólni
ez az egyik:
Method
A panel of SARS-CoV-2 positive and negative samples was used to compare the RNA extraction and RNA-extraction free methods.
RNA extraction
100 μL viral transport medium (VTM) from a swab was added to 100 μL Qiagen Lysis buffer containing guanidinum to inactivate the virus. This was then processed either on a QIAsymphony SP using the QIAsymphony DSP Virus/pathogen Mini kit and Complex 200 protocol, or the EZ1 Advanced XL using the EZ1 DSP virus kit. The elution volume was set to 60 μL, and 10 μL of the purified RNA was added to the PCR.
Direct sample transfer:
10 μL, 5 μL and 2 μL of sample expressed in viral transport medium was added directly to the PCR without any heating step, the plate was sealed and thermal cycling begun.
Sample heating prior to direct transfer
50 μL of sample expressed in viral transport medium was added to a PCR tube and heated to 95 °C for 10 mins prior to loading into the PCR at 10ul, 5 μL and 2 μL.
RT-PCR
A 20 μL reaction containing 10 μL RNA, 5 μL 4x TaqMan Fast Virus 1-step Master Mix (Applied Biosystems) and 5 μL primer and probe mix as shown in Table 1. Where VTM was added directly to the PCR at 5 μL or 2 μL, this was made up to 10 μL with RNase-Free water.
Cycling was performed at 56 °C for 15 min for reverse transcription, followed by 95 °C for 20 sec and then 45 cycles of 95 °C for 3 s, 60 °C for 30s using an Applied Biosystems QuantStudio 5 real-time PCR system (ThermoFisher Scientific).
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 3:05:43 PM4/13/20
to Suppress19
következő anyag - amiben nem értem, hogy mit ért a "directly" alatt:
"...Using flu and RSV clinical specimens, we have collected evidence that the RT-qPCR assay can be performed directly on patient sample material from a nasal swab immersed in virus transport medium (VTM) without an RNA extraction step. We have also used this approach to test for the direct detection of SARS-CoV-2 reference materials spiked in VTM. Our data, while preliminary, suggest that using a few microliters of these untreated samples still can lead to sensitive test results. If RNA extraction steps can be omitted without significantly affecting clinical sensitivity, the turn-around time of COVID-19 tests and the backlog we currently experience can be reduced drastically. Next, we will confirm our findings using patient samples."
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 3:21:53 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
ez nem RT-PCR, hanem LAMP, de beteszem, hátha van benne valami okosság.
Viktória Lázár
Apr 13, 2020, 3:36:45 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
One-step RNA extraction for RT-qPCR detection of 2019-nCoV
DIRECT RT-qPCR DETECTION OF SARS-CoV-2 RNA FROM PATIENT NASOPHARYNGEAL SWABS WITHOUT AN RNA EXTRACTION STEP
Ak...@TorokCsalad.hu <torok...@torokcsalad.hu> ezt írta (időpont: 2020. ápr. 13., H, 22:21):
ez nem RT-PCR, hanem LAMP, de beteszem, hátha van benne valami okosság.
--
ÚJDONSÁG: a csoportban való _alkató_ részvétel esetén elfogadod az itt leírt értékrendet: https://sites.google.com/a/torokcsalad.hu/poroly/home
Ha csak olvasás céljából csatlakoztál a listához, akkor természetesen nincs ezzel dolgod, nem kell ezt elfogadni.
---
You received this message because you are subscribed to the Google Groups "suppress-covid19" group.
To unsubscribe from this group and stop receiving emails from it, send an email to suppress-covid19-p...@googlegroups.com.
To view this discussion on the web visit https://groups.google.com/d/msgid/suppress-covid19-pandemic/CAKDdW8B-JibxHL8HZQsmn7-qHS3_DnLc90bQae3WnDSB80rv0Q%40mail.gmail.com.
Viktoria Lazar (Ph.D.)
Lab of Kishony
Emerson Life Sciences Building
Department of Biology, Technion – Israel Institute of Technology
Haifa 32000, Israel
http://kishony.net.technion.ac.il/people-2/
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 3:38:18 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
itt a kövi: esküszom nem értem, itt is direkt a PCR-be pakolásról szól?
ABSTRACT The ongoing SARS-CoV-2 pandemic has caused an unprecedented need for rapid diagnostic screening [1]. The primary assay employed is a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) assay that requires the use of an RNA extraction kit [2,3]. In the United States, the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) protocol requires the use of the Qiagen QIAamp DSP Viral RNA Mini kit. The current shortage of this RNA extraction kit during this pandemic has resulted in a severe bottleneck in testing capacity. To address this problem, we tested two alternative strategies: the use of alternative RNA extraction kits or a direct RT-qPCR assay that omits an RNA extraction step altogether. We found that the Qiagen RNeasy Mini kit and the Qiagen RNeasy Micro kit could be substituted for the QIAamp Viral RNA Mini kit. Importantly, we report here that the RT-qPCR assay can be performed directly on patient sample material from a nasal swab, without the need for an RNA extraction step of any kind. Collectively, our findings provide viable options to circumvent supply chain issues in COVID-19 testing. Further, the ability to omit the RNA extraction step from RT-qPCR screening protocols would drastically ease supply chokepoints of COVID-19 screening and should be applicable throughout the world. We would note that our findings are preliminary and based on a single pooled nasopharyngeal swab sample from two previously confirmed positive COVID-19 patients. But due to the urgent need for high volume COVID-19 screening, we wanted to make these findings available immediately while we conduct replicate studies using additional patient samples.
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 3:48:28 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
ez már volt másik szálon, a qSanger megoldás, de hátha valaki itt futja át egyben a megoldásokat: https://static.comunicae.com/files/notas/2020/04/1213618/1213618-1586254431035.pdf
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 3:53:40 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
itt egy "5 perces" megoldás:
nemtom ez egy reklám-e, merthogy ez a reagens: Quick Extract DNA Extraction Solution (QE09050), Lucigen.
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 4:03:54 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
ez itt lysis buffer összehasonlítás szép grafikonokkal asszem, fizetősök és open source cuccok:
Validation of a Lysis Buffer Containing 4 M Guanidinium Thiocyanate (GITC)/ Triton X-100 for Extraction of SARS-CoV-2 RNA for COVID-19 Testing: Comparison of Formulated Lysis Buffers Containing 4 to 6 M GITC, Roche External Lysis Buffer and Qiagen RTL Lysis Buffer
Viktória Lázár
Apr 13, 2020, 4:35:35 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
Csoda transfer medium:
--
ÚJDONSÁG: a csoportban való _alkató_ részvétel esetén elfogadod az itt leírt értékrendet: https://sites.google.com/a/torokcsalad.hu/poroly/home
Ha csak olvasás céljából csatlakoztál a listához, akkor természetesen nincs ezzel dolgod, nem kell ezt elfogadni.
---
You received this message because you are subscribed to the Google Groups "suppress-covid19" group.
To unsubscribe from this group and stop receiving emails from it, send an email to suppress-covid19-p...@googlegroups.com.
To view this discussion on the web visit https://groups.google.com/d/msgid/suppress-covid19-pandemic/CAKDdW8B%3Dy2ysbnY0mt55k_BgF-rhu1YPZzFoOt%3DMpx7yZ%3DDKqg%40mail.gmail.com.
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 4:37:07 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
igen, ez maga az olasz meló törökországból
torok...@torokcsalad.hu
Apr 13, 2020, 4:37:52 PM4/13/20
to suppress-cov...@googlegroups.com
ez valami influenza RNS-re történt fejlesztés: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3348996/
Viktória Lázár
Apr 14, 2020, 4:05:23 PM4/14/20
to suppress-covid19
A reagensnek az a különlegessége, hogy 1 mixbe tartalmazza a reverz transzkripcióhoz szükséges dolgokat és a PCR-hoz szükséges dolgokat. Ez a gyorsaság szempontjából előnyös.Nem igazán volt alkalmam még végig futni más cikkeken, de megosztanám a tapasztalataimat. (Nem tudom kinek milyen háttértudása van ezért elnézést ha evidenciákat írok le. :) )Ugye egy klasszikus RT-QPCR munkamenete valami ilyesmi: mintagyűjtés és feltárás - RNS izolálás - reverz transzkripció - RT-PCREzek mindegyike optimalizálható külön-külön, és részben ezért viszonylag időigényesek. Viszont akárhányszor megpróbálunk spórolni egy lépéssel, akkor magát a PCR reakciót veszélyeztetjük, hiszen egyre több változót viszünk be a rendszerbe. Ugyanakkor ha egy primerpár jól működik, akkor az a reakció elég robosztus lesz, és így végső soron a mi igen/nem kérdésünkre is választ tud adni.Az RNS izolálás célja, hogy az RNS-en kívül más ne legyen az oldatunkba. - A folyamat végén ez egy meghatározott puffert jelent meghatározott sókoncentrációval, és meghatározott RNS koncentrációval, PCR inhibitorok és RNázok nélkül. A cikkben( Extraction-free COVID-19 (SARS-CoV-2) diagnosis by RTPCR to increase capacity for national testing programmes during a pandemic https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.06.028316v2.full.pdf ) ezt hagyták ki, ergo random RNS koncentrációt, többé kevésbé változó sókoncentrációt, kelátolók, PCR inhibitorok és RNázok jelenlétét kockáztatják (gondolom ezért nézegettük tegnap a feltáró puffereket, amikben valamilyen RNáz inhibitor is van). Ezért ha ki akarjuk hagyni a pucolást, akkor olyan feltáró puffert szerencsés választani, ami a reverz transzkriptáz és a PCR pufferhez is közel áll - bár gyanítom a pufferek közötti funkcionlis különbség ebben nem nagy segítség. Szóval erre érdemes figyelni a cikkekben, hogy mit használtak feltárásnál, valószínűleg lesz egy rakat verzió ebből is... Elég valószínűnek tartom, hogy kiemelten kell figyelni a feltárás és a PCR reakció között eltelt idő minimalizálására is...A random RNS koncentráció miatt, érdemes a lehető legnagyobb térfogatban használni a feltárt RNS - hiszen a lehető legtöbb templátot szeretnénk a reakcióba vinni. Ugyanakkor a sok egyéb szemét is bekerül a reakcióba akkor az veszélyezteti a reakciót - lásd a cikkben, amikor a végtérfogat 50%-a volt a templát nem is működött a PCR. Ugyanakkor ilyen megközelítést DNS jellegű templátok alapján rendszeresen használunk: mi különösebb tisztogatás nélkül proteázzal kezelt szétnyomkodott legyekből szoktunk PCR-t készíteni, valamint a kolónia PCR is tud szépen működni (néha optimalizálni kell). Érdekes módon a kolónia PCR esetén szoktunk kapni gyenge fals pozitív jeleket - ami egy rendes pozitív kontrollal szűrhető ki (állítólag a bacik által fel nem vett, a lemezre szélesztett DNS szennyeződés jön fel...). - Kolónia PCR-ral volt még egy olyan esetünk, hogy az egyik szakdolgozó fele mennyiségben mérte bele a reakcióba a puffert, és ez nem okozott problémát a reakció működésében.Szóval ez simán működhet (és a cikkek száma alapján működött is sokaknak).A reverz transzkripció (RT) az megint egy időigényesebb lépés - ugye a reakció szükségletei azok eléggé hasonlítanak a PCR-ra. Ami belemegy a reakcióba az a puffer, RNS templát, dNTP, primerek, RNáz inhibitor, reverz transzkriptáz. Az általunk használt RT kitek esetén ez egy reakciót figyelembe véve 20 mikrol végtérfogat esetén max 11 mikrol mintának ad helyet (és kockáztatjuk a reakciót azzal, hogy nem pucolt az RNS). Ez nagyjából egy 2X hígítást eredményez a mintában. Összemérjük, mehet a PCR gépbe. A reakciót követően elkészül a cDNS (ugye 1:1 arányban az RNS-sel, a szintézis során a reverztranszkriptáz elemészti a templátot). Ez ilyen formában egy olyan lépés ami termel 20 mikrol cDNS-t amiből 0.5-5 mikrol (ált cc függvényében) mehet PCR reakcióba. (Ez diagnosztikai értelemben pocsékolás... ezért is jobb a kit)A kit amit használtak és belinkeltem, az tulajdonképpen egy újabb spórolás - idő és anyag szempontjából - mert az RT-t nem kell külön összemérni. (Igazából elég logikus, hiszen cDNS szintézis meg a sima PCR hasonló puffereket igényel - és a megfelelő programmal, még a PCR gépet sem kell nyitogatni... ) Egy ilyen reakció elegy előállítása házilag lehetséges, de szerintem nem kevés optimalizációt igényel. Azért jobb volna a kit, szerintem minden nagyobb gyártónak lehet saját belőle. Viszont itt megint kérdéses a piac helyzete...
torok...@torokcsalad.hu
Apr 14, 2020, 4:11:18 PM4/14/20
to suppress-cov...@googlegroups.com, balazs.x...@gmail.com
Szia Balázs,
Ez a levlistánk, és ezen a szálon megy a VTM keresése, amiről írok (azaz itt láthatóak az anyagok, amit ezügyben összeszedtünk:
https://groups.google.com/d/msgid/suppress-covid19-pandemic/CAEV7su34UGwg8Tw7%3DDd4%2B%2BRBn7S4PZ1f%2Bq7fXOV_Um7NhEJN5w%40mail.gmail.com. )
A mailcímet fent látod. A web:
https://sites.google.com/a/torokcsalad.hu/poroly/home Ott a "matek" részen van a poolozási optimalizáció.
Várjuk-várom az ismerősöd jelentkezését, mert nagyon kell most megoldás erre a VTM kérdésre. Ha ide ír, akkor az azért jó, mert a többi biológus is olvassa, és tudnak egymással egyeztetni. (Értelemszerű, hogy az ismerősödnek alapvetően ez üzlet, szóval a projekt szempontjából ez nem alkotó hozzájárulás, nem kell elfogadnia a levlista és a projekt értékrendjét)
Ha bármit elfelejtettem volna, kérlek, írj, pótlom!
Üdv,
Ákos
ÚJDONSÁG: a csoportban való _alkató_ részvétel esetén elfogadod az itt leírt értékrendet: https://sites.google.com/a/torokcsalad.hu/poroly/home
Ha csak olvasás céljából csatlakoztál a listához, akkor természetesen nincs ezzel dolgod, nem kell ezt elfogadni.
---
You received this message because you are subscribed to the Google Groups "suppress-covid19" group.
To view this discussion on the web visit https://groups.google.com/d/msgid/suppress-covid19-pandemic/CAEV7su34UGwg8Tw7%3DDd4%2B%2BRBn7S4PZ1f%2Bq7fXOV_Um7NhEJN5w%40mail.gmail.com.
torok...@torokcsalad.hu
Apr 21, 2020, 3:59:11 PM4/21/20
to Suppress19
Varga Dani vadászta: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.17.20067348v2
Reply all
Reply to author
Forward
0 new messages