Spectrométrie De Masse En Tandem

[Agnella Datson]

Laspectromtrie de masse MS/MS sert dterminer la squence des peptides sur quelques dizaine d'acides amins. Coupl avec des techniques de digestion (enzymatiques ou chimiques) et avec des techniques de sparation (chromatographie en phase liquide haute performance par exemple), il est envisageable de caractriser une protine.

La fragmentation est le processus servant sparer chaque acide amin d'un peptide. Pour des raison de stabilit des liaisons, les squences polypeptidiques se clivent prfrentiellement au niveau des liaisons peptidiques. Il existe cependant des mcanismes complexes qui produisent d'autres types ruptures de liaison, ce qui peut rendre complexe la lecture des spectres de masses et la dtermination de la squence.

Pour fragmenter les peptides, on utilise soit plusieurs analyseurs coupls en srie (spectromtre de type triple quadripoles QqQ ou de type quadripole-temps de vol Q-TOF) ou un analyseur capable de raliser plusieurs analyses en srie (spectromtre de masse de type trappe ionique IT ou de type rsonance cyclotronique FT-ICR).

En particulier, dans le cas d'une digestion trypsique, l'acide amin C terminal correspond une lysine ou une arginine. Selon cet acide amin, on observe un pic qui apparait aux diffrence suivante compar au rapport m/z de l'ion parent [M+H]+ :

La spectromtrie de masse (mass spectrometry ou MS) est une technique physique d'analyse servant dtecter et d'identifier des molcules d'intrt par mesure de leur masse mono-isotopique. De plus, la spectromtrie de masse sert caractriser la structure chimique des molcules en les fragmentant.

Son principe rside dans la sparation en phase gazeuse de molcules charges (ions) selon leur rapport masse/charge (m/z). La spectromtrie de masse est utilise dans quasiment l'ensemble des domaines scientifiques : physique, astrophysique, chimie en phase gazeuse, chimie organique, dosages, biologie, mdecine...

Le spectromtre de masse, originellement conu par le britannique Joseph John Thomson, comporte une source d'ionisation suivie d'un ou plusieurs analyseurs qui sparent les ions produits selon leur rapport m/z, d'un dtecteur qui compte les ions et augmente le signal, et enfin d'un dispositif informatique pour traiter le signal. Le rsultat obtenu est un spectre de masse reprsentant les rapports m/z des ions dtects selon l'axe des abscisses et l'abondance relative de ces ions selon l'axe d'ordonnes.

Ces analyseurs peuvent tre coupls entre eux pour raliser des expriences de spectromtrie de masse en tandem (MS/MS). Gnralement, un premier analyseur spare les ions, une cellule de collision sert fragmenter les ions, et un second analyseur spare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les piges ions ou le FT-ICR, forment plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.

Les ionisations EI et CI, qui ncessitent un certain niveau de vide, sont prfrentiellement utilises en couplage avec la chromatographie en phase gazeuse (la CI fonctionnant partir d'une source EI). Par contre, les deux sources pression atmosphrique (lectrospray et APCI) dites "ionisation douce", sont essentiellement utilises en couplage avec la chromatographie en phase liquide.

Des lectrons mis par un filament rencontrent les molcules qui entrent dans la source : lors de la rencontre, si l'nergie cintique des lectrons est suffisante, un lectron est arrach de la molcule M, la transformant en un ion radical M+o. Ce dernier peut ensuite se fragmenter suivant son nergie interne. L'EI conduit ainsi un spectre assez apport, avec de nombreux fragments, particulirement riche en informations structurales.

En plus du systme EI ci-dessus, un gaz ractif est introduit dans la source et ionis par impact lectronique. S'ensuit une srie de ractions qui donne naissance des ions pouvant ragir avec les molcules d'analyte arrivant dans la source. Ce type de ractions ions-molcules produit essentiellement (en mode positif) des ions [MH] +, et [M+adduit+H]+, donnant la possibilit ainsi d'accder la masse molculaire de l'analyte.

Le mthane, l'isobutane et l'ammoniac sont parmi les gaz d'ionisation chimique les plus utiliss.

Son principe est le suivant : pression atmosphrique, les gouttelettes de soluts sont constitues l'extrmit d'un fin capillaire de silice, mtallis en surface et port un potentiel lev. Le champ lectrique intense leur confre une densit de charge importante. Sous l'effet de ce champ et grce l'assistance ventuelle d'un courant d'air co-axial, l'effluent liquide est transform en nuage de fines gouttelettes (spray) charges suivant le mode d'ionisation. Sous l'effet d'un second courant d'air chauff, les gouttelettes s'vaporent progressivement en perdant des molcules de solvant par des mcanismes complexes de dsolvatation et d'vaporation. Leur densit de charge devenant trop importante, les rpulsions lectriques atteignant le niveau des tensions superficielles, les gouttelettes explosent en librant des microgouttelettes constitues de molcules protones ou dprotones de l'analyte, porteuses d'un nombre de charges variable.

Les ions ainsi constitus sont ensuite guids avec potentiels lectriques appliqus sur deux cnes d'chantillonnage successifs jouant le rle de barrires avec les parties en aval tenues sous un vide pouss (

Les chantillons liquides sont directement introduits dans un nbuliseur pneumatique. Sous l'effet d'un jet d'air ou d'azote, le liquide est transform en fin brouillard. Un chauffage assure la dsolvatation des composs. Ces derniers sont ensuite ioniss chimiquement pression atmosphrique : gnralement, la phase mobile vaporise joue le rle de gaz d'ionisation et les lectrons sont obtenus partir de dcharges d'lectrode couronne. L'ionisation des composs est particulirement favorise lors de ces techniques car la frquence des collisions est leve pression atmosphrique.

L'APCI est une technique analogue l'ionisation chimique (CI), elle fait appel des ractions ions-molcules en phase gazeuse, mais pression atmosphrique et conduit principalement la formation d'ions [MH]+ ou [M-H]-.

Un faisceau laser puls est utilis, le plus souvent dans le domaine des ultraviolets, pour dsorber et ioniser un mlange matrice/chantillon cocristallis sur une surface mtallique, la cible.

Les molcules de matrice absorbent l'nergie transmise par le laser sous forme de photons UV, s'excitent et s'ionisent. L'nergie absorbe par la matrice provoque sa dissociation et son passage en phase gazeuse. Les molcules de matrice ionises transfrent leur charge l'chantillon. L'expansion de la matrice entrane l'chantillon au sein de la phase gazeuse dense o il va finir de s'ioniser.

L'ionisation de l'chantillon a par consquent lieu soit dans la phase solide avant la dsorption, soit par transfert de charge lors de collisions avec la matrice excite aprs dsorption. Elle conduit la formation d'ions monochargs et multichargs de type [M+nH]n+, avec une nette prpondrance pour les monochargs.

C'est une petite molcule, capable de former des cristaux contenant l'analyte. Elle a pour proprit de fortement absorber la longueur d'onde du laser. Elle assure ainsi la stabilit de l'chantillon, le prservant d'une dgradation trop importante par les photons.

Il est envisageable d'utiliser des matrices varies, dont normment sont drives de l'acide cinnamique (acides gentisique (DHB), α-cyano-4-hydroxycinnamique (α-HCCA), sinapinique (SA), ... ). Cependant aucune rgle gnrale ne rgit vraiment leur choix pour une application, mme si l'α-HCCA est frquemment utilis pour l'analyse de peptides, alors que le SA convient bien l'tude des protines.

En appliquant cette diffrence de potentiel entre chaque paire d'lectrodes, il se cre un champ lectrique quadripolaire. Un point de coordonnes (x, y, z) localis dans le champ lectrique sera alors soumis au potentiel :

La trajectoire d'un ion pntrant dans le quadriple sera par consquent uniforme selon l'axe z et dcrite par les quations de Mathieu selon les deux autres axes. Il est envisageable de dfinir suivant les valeurs U et V des zones de stabilit telles que les coordonnes x et y de l'ion restent strictement infrieures r0. L'une d'entre elles est exploite en spectromtrie de masse (voir figure) (Les ions qui se trouvent dans cette zone auront par consquent une trajectoire stable dans le quadripole et seront dtects). En gardant constant le rapport U/V, on obtient une droite de fonctionnement de l'analyseur. Un balayage de U avec U/V constant permet l'observation successive de l'ensemble des ions dont la zone de stabilit est coupe par la droite de fonctionnement. La rsolution entre ces ions est d'autant plus grande que la pente de la droite est leve.

En l'absence de tension continue, l'ensemble des ions de rapports m/z suprieurs celui fix par la valeur de V applique auront une trajectoire stable (x et y r0), le quadriple est alors dit transparent et sert de focalisateur d'ions.

Les principaux avantages du spectromtre quadripolaire rsident dans sa souplesse d'utilisation, sa rsolution unitaire sur toute sa gamme de masse, sa vitesse de balayage satisfaisante, mais aussi son adaptabilit diffrentes interfaces donnant la possibilit le couplage avec la chromatographie gazeuse ou liquide.

C'est un pige ionique o la prparation, l'analyse et la dtection des ions s'effectuent dans un mme espace, suivant des squences temporelles successives.

Le pige est constitu de trois lectrodes section hyperbolique : une lectrode annulaire encadre par deux lectrodes (d'entre et de sortie) qui forment les calottes suprieure et infrieure du systme. Une tension en radiofrquence combine ou non une tension continue U est applique entre l'lectrode centrale et les deux lectrodes calottes. Le champ rsultant est alors tridimensionnel.

Les domaines de stabilit des ions sont nouveau dtermins par les quations de Mathieu. Celui exploit est dfini tel que quand les ions en sortent, leur trajectoire radiale reste stable au contraire de celle selon l'axe des z. Un balayage de l'amplitude de la radiofrquence V entranera par consquent l'expulsion des ions pigs selon cet axe, vers le dtecteur. Les trajectoires stables des ions, au sein du champ quadripolaire rsultant sont tridimensionnelles, en forme de huit.

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