Re: Deteksiyon Nedir Tıp
Garcia Miller
Doğrudan ELISA deneylerine benzer şekilde, antijen ok kuyucuklu plakanın yzeyine sabitlenir. Bununla birlikte, deteksiyon iin, antijene zg bir primer antikorun hedefe bağlandığı ve primer antikorun konak trlerine karşı etiketlenmiş bir sekonder antikorun deteksiyon iin primer antikora bağlandığı iki aşamalı bir sre gereklidir.
Sandvi ELISA (veya sandvi immnoassay) en yaygın kullanılan biimdir. Bu tr, antijenin farklı epitoplarına zg iki antikor gerektirir. Bu iki antikor genellikle, eşleşen antikor iftleri olarak adlandırılır. Antikorlardan biri, birden ok kuyucuklu plakanın yzeyi zerinde kaplanır ve antijenin sabitlenmesini kolaylaştırmak iin bir yakalama antikoru olarak kullanılır. Diğer antikor konjuge edilir ve antijenin deteksiyonunu kolaylaştırır.
SimpleStep ELISA kitleri markamız, geleneksel bir ELISA kitinin bilinen srecini ve standart veri ıkışını koruyarak gelişmiş hız ve performans sağlar. SimpleStep ELISA kitleri, sandvi kompleksi oluşumunu sıralı bir şekilde değil, tek adımda sağlayarak yıkama adımlarının sayısını azaltır. Gereken toplam sre iki saatten azdır.
İnhibisyon ELISA veya kompetitif immnoassay olarak da bilinen bu deney, sinyal mdahalesini saptayarak bir antijenin konsantrasyonunu ler. nceki trlerin her biri kompetitif tre uyarlanabilir. Numune antijen, belirli bir miktarda etiketlenmiş antikora bağlanmak iin bir referans antijenle rekabet eder. Referans antijen, birden ok kuyucuklu bir plaka zerinde nceden kaplanmıştır. Numune, etiketli antikorla nceden inkbe edilir ve kuyucuklara eklenir. Numunedeki antijen miktarına bağlı olarak, referans antijeni bağlamak iin aşağı yukarı bağımsız antikor mevcut olacaktır. Bu, numunede ne kadar ok antijen varsa, o kadar az referans antijenin saptanacağı ve sinyalin o kadar zayıf olacağı anlamına gelir.
Bazı kompetitif ELISA kitleri, etiketli antikor yerine etiketli antijen kullanır. Etiketli antijen ve (etiketlenmemiş) numune antijeni, primer antikora bağlanmak iin rekabet eder. Numunedeki antijen miktarı ne kadar dşkse, kuyucukta daha ok etiketli antijen bulunduğu iin sinyal o kadar gldr.
SimpleStep ELISA kitleriyle, solsyon iinde, bir analit yakalama ve dedektr antikor sandvi kompleksi oluşturulur. Sadece tek bir inkbasyon ve yıkama aşamasında, tam sandvi kompleksi kuyucukta oluşur ve bir immnoafinite etiketiyle plakaya sabitlenir.
CatchPoint SimpleStep ELISA kitleri, kolorimetrik ELISA kitleri ile karşılaştırıldığında, genişletilmiş bir dinamik aralık zerinde, gelişmiş doğrusallığı sağlamak iin bir floresan substrat kullanılarak geliştirilmiştir. Genişletilmiş dinamik aralık, eğrinin hem alt hem de st ucunda daha iyi miktar lm sağlar.
Eşleşen antikor ifti kitleri, titre edilmiş bir yakalama ve biyotinlenmiş dedektr antikor ifti ve kalibre edilmiş bir protein standardı ierir. Kitler, standart bir sandvi ELISA kullanan 2 veya 10 x 96 kuyucuklu plakalar iin yeterli reaktifleri ierir ve iki boyutta mevcuttur.
Deney performansının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi, yeni bir ELISA kiti semek konusunda nemli bir ilk adımdır. nemli parametreler, oğu ELISA kiti iin bahsedilen hassasiyeti, dinamik aralığı ve kesinliği kapsar. Diğer parametreler, tipik numune trlerine dair ELISA performansı konusunda daha belirleyicidir. Dilsyonun yzde (%) geri kazanımı ve doğrusallığı, plazma, serum veya hcre kltr medyumu gibi gerek numunelerdeki hedef proteini ler.
* Belli bir ELISA kitinin hassasiyetinin ve dinamik aralığının uygun olup olmadığını kontrol etmek iin, bir numunede hedef proteinin hangi seviyelerinin beklendiğini bilmek nemlidir. Hedef proteinin yksek konsantrasyonlarına sahip olan numuneler, ham sinyalin, testin dinamik aralığı iinde kalabilmesi iin seyreltilebilir.
Bu iki parametre iin bildirilen değerler yanıltıcı olabilir nk bunlar genellikle basit tamponlarda standart protein kullanılarak belirlenir. Bu, biyolojik bir numunede endojen bir proteinin saptanma kinetiğini yansıtmayabilir.
CV, genellikle, alışmalar arası kesinliği veya plakadan plakaya tutarlılığı ve alışma ii kesinliği veya aynı deneyde işlem gren eşler arasındaki tutarlılığı değerlendirmek iin hesaplanır.
Yzde (%) geri kazanımı, belli bir miktarda saflaştırılmış hedef proteinin bir biyolojik numune trne (numune matrisi olarak da adlandırılır) eklenmesiyle belirlenir. Sitokinler gibi salgılanan proteinler iin, tipik numune matrisleri plazma ve serumdur; kinazlar gibi hcre ii proteinler iin, numuneler hcre kltr lizatlarıdır.
Bu ynergelerin, ELISA deneylerinde kullanılmak zere, yaygın olarak test edilen numuneleri hazırlamak iin bir eğitim kaynağı olması amalanmaktadır. En uygun numune hazırlama prosedrleri, ilgili hedef ve teste bağlı olarak değişecektir. Yeni bir deney geliştirirken, sizinkine benzer deneysel rnekler iin literatre başvurmak her zaman iyi bir uygulamadır.
Gerekli kontrolleri yerine getirmek, doğru pozitif sonuları, olası yanlış sonulardan kesin bir şekilde ayırmanıza yardımcı olur. Pozitif ve negatif kontroller, protokolnzde sorun gidermeniz gerektiğinde de faydalı olacaktır. Burada, bir ELISA alıştırırken kullanmanız gereken eşitli kontrol numunesi trlerini aıklıyoruz.
Tespit ettiğiniz proteini ierdiği bilinen endojen bir zlebilir numune veya kullandığınız antikor iin immnojen dizisini ierdiği bilinen saflaştırılmış bir protein veya peptit kullanın. Pozitif kontrolden alınan pozitif bir sonu, numuneler negatif olsa bile, uygulanan işlemin optimize edildiğini ve alıştığını gsterir. Bu, herhangi bir negatif sonucun geerli olduğunu doğrulayacaktır.
Bu, saptadığınız proteini aığa ıkarmadığını bildiğiniz bir numunedir ve spesifik olmayan bağlanmayı ve yanlış pozitif sonuları kontrol etmenizi sağlar. Kullandığınız her plaka, sonuları doğrulamak iin bir negatif kontrol numunesi iermelidir.
Bu, standart eğrinin elde edilebileceği hedef proteinin bilinen bir konsantrasyonunu ieren bir numunedir. rneğin aşağıda, Fare IL-6 ELISA kitimizin (ab46100), 15.6 ila 500 g/mL arasında değişen konsantrasyona sahip tipik bir standart eğrisi bulunmaktadır. Zayıf bir standart eğri, antikorun dzgn bağlanmadığı veya protein standardını yakalamadığı anlamına gelir. Eğim izgisinin R2 değeri >0,99 olmalıdır.
Dikkate alınması gereken rekombinant proteinlerin antikor deteksiyonunun kendinde var olan zorlukları bulunmaktadır. Rekombinant proteinin katlanması, endojenin doğal formundan farklı olabilir ve antikorun epitopa erişimini engelleyebilir. Bu, zellikle etiketli proteinler iin geerlidir. Her zaman etiketlerin, rekombinant proteinin N veya C-terminal ucuna yerleştirildiğinden emin olun.
En nemlisi, her zaman rekombinant proteinin, kullandığınız antikorun immnojen dizisini ierdiğinden emin olun. Endojen bir pozitif kontrol, sonuları doğrulamak ve ayrıca reaktiflerin (rn. antikorlar) ve uygulanan işlemin ne kadar iyi alıştığını gstermek iin nemlidir.
Monoklonal veya poliklonal antikorlar, sandvi ELISA sistemlerinde, yakalama ve deteksiyon antikorları olarak kullanılabilir. Monoklonal antikorlar, kk antijen farklılıklarının miktarını belirlemeyi sağlayan tek bir epitop tanırlar. Poliklonal antikor genellikle, mmkn olduğu kadar ok antijeni ekmek iin yakalama antikoru olarak kullanılır.
Standartların konsantrasyonunun, antikor bağlanmasının en dinamik deteksiyon aralığını kapsadığından emin olun. Uygun bir standart eğrisi elde etmek iin konsantrasyon aralığını optimize etmeniz gerekebilir. Numuneleri ve standartları her zaman ikili veya l eşler halinde alıştırın.
Deteksiyon antikorunun, yakalama antikoruna gre, hedef protein zerinde farklı bir epitop tanıyıp tanımadığını kontrol edin. Bu, antikor bağlanmasına mdahaleyi nler. Mmkn olduğunda, test edilmiş eşleşen bir ift kullanın.
Bazı biyolojik rnlerin yksek dzeyde endojen enzim aktivitesine (alveolar hcrelerde yksek ALP, kırmızı kan hcrelerinde yksek peroksidaz gibi) sahip olduğunu ve bunun da spesifik olmayan sinyale neden olabileceğini gz nnde bulundurun. Gerekirse, (ALP iin) levamisol veya (peroksidaz iin) metanol iinde %0,3 H2O2 ile ek bir bloklama işlemi gerekleştirin.
X ekseninde konsantrasyon (log leği) ve Y ekseninde (doğrusal) absorbans ile seri dilsyon verilerinden standart bir eğri hazırlayın. Bu standart eğriden numunenin konsantrasyonunun ara değerini hesaplayın.
oğu ELISA plaka okuyucusu, eğri ayarlama ve veri analizi iin bir yazılım ierecektir. Numunedeki antijen konsantrasyonu, standart eğrinin doğrusal kısmından ekstrapolasyon yapılarak hesaplanır.
Yazılımınız bunu sağlıyorsa, 4-PL ve 5-PL, oğu ELISA kalibrasyon standart eğrisine uyacaktır. Yazılımınız bunu sağlamıyorsa, en iyi seenek, yarı logaritmik veya log/logaritmik bir izim kullanmaktır.
ELISA numunelerini her zaman iki aynı eş veya aynı eş halinde alıştırın. Bu, sonuların istatistiksel olarak doğrulanması iin yeterli veri sağlayacaktır. ELISA sonularını bu şekilde işlemeye yardımcı olan birok bilgisayar programı artık mevcuttur.
Protein konsantrasyonuna (x ekseni) karşı ortalama absorbansı (y ekseni) izerek hedef protein iin standart bir eğri oluşturun. Grafikteki noktalar zerinden en uygun eğriyi izin (bunun iin uygun bir bilgisayar programının kullanılmasını neririz).
Bir pozitif kontrol olarak, bilinen bir konsantrasyon numunesi kullanmanızı neririz. Geerli ve doğru sonular elde etmek iin, pozitif kontrol numunesinin konsantrasyonu, standart eğrinin doğrusal kesiti iinde olmalıdır.
Her bir numunede hedef protein konsantrasyonunu belirlemek iin, ncelikle numunenin ortalama absorbans değerini bulun. Standart eğri grafiğinin Y ekseninden, bu absorbans değerinden standart eğriye yatay bir izgi uzatın.
Doğru bir sonu elde etmek iin, bu numuneler, ELISA boyama ile işlem grmeden nce seyreltilmelidir. Bu numuneler iin, sonular analiz edilirken standart eğriden elde edilen konsantrasyon, dilsyon faktryle arpılmalıdır.
d3342ee215