Western blot

[Xijun Wang]

做WB的时候，先定量内参B-ACTIN, 然后ECL 显影，再用软件分析ECL结果，根据结果去重调上样量均一化内参，但是重调上样量后，发现显影
的B-ACTIN差别更加离谱了，做了3次重调显影了，差别很大，请问怎么办呢

[Redondo]

测total的浓度以后，内参应该差别不会很大才对啊。

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2011/4/18 Xijun Wang <xijun...@gmail.com>

[Zhihao Zheng]

对啊。我也是觉得这样。只要保证每个处理的细胞密度一致。收了蛋白后测的内参应该差别不会很大。

2011/4/18 Redondo <redon...@gmail.com>

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Best regards,

Zhihao Zheng
Department of Pharmacology
Zhongshan School of Medicine
Sun Yat-sen University
No.74 Zhongshan Road II
Guangzhou 510080
China
Tel:086-013760846681 
Email:zzhe...@gmail.com

[衣 大龙]

底片上显影后用软件测的结果和实际样本量并不一直都是呈线性关系的，一般来讲将只有在浓度较低范围内或是显影时间较短的情况下才会有这个关系。软件测的结果和浓度的关系其实是呈现一个S型曲线的，浓度过高了就会出现饱和现象。
我的建议，如果要解决这个问题，1是要做一个浓度大范围的浓度梯度，2 如果目标蛋白是在样本中表达（也就是说不是在原核或酵母中进行过量表达的情况下），较为准确的测量好总蛋白量，会很有助与解决这个问题的。3 我几乎不相信用计算机软件对照片或者什么的进行定量的结果。

[Redondo]

大龙，好解。你不相信计算机软件对照片或者什么的进行定量的结果？我现在有个问题，做quantitative WB，用已知量的纯化的蛋白作为标准去估计体内的表达水平，你觉得是否可行？

Profile：http://goo.gl/HOn65

2011/4/19 衣 大龙 <yida...@gmail.com>

[衣 大龙]

这个，应该可以。我主要是不相信放射自显影，辣根酶什么这类显影后在用图像分析软件的结果。至于通过免疫荧光等方法的话，如果机器能保证（就是直接度数的那种），设置好对照内参，着好条件，我觉的应该可以。这个我就没有做过了，不过这边有人用免疫荧光的方法测量活体胞内蛋白含量，我估计这个方法应该是可用的