spettrometria s fluorimetria
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avrei bisogno di un chiarimento...
qualcuno di voi sa spiegarmi la differenza tra fluorimetria e
spettroscopia? sono la stessa cosa?
Cosa differenzia uno spettrometro da un fluorimetro?
grazie mille :)
Opus
Alexienovich
> avrei bisogno di un chiarimento...
> qualcuno di voi sa spiegarmi la differenza tra fluorimetria e
> spettroscopia? sono la stessa cosa?
> Cosa differenzia uno spettrometro da un fluorimetro?
intanto leggiti questa pagina (la prima che ho trovato ma sicuramente ce ne
sono molte altre):
http://www.pacifici-net.it/biologia/Metodologie_Biochimiche/le_tecniche_spettroscopiche.htm#nellultravioletto%20e%20nel%20visibile
poi fai delle domande più miratre. le tue domande prevedono un trattato.
ciao, Alessio
La spettrofluorimetria
La fluorescenza è un fenomeno di emissione in cui si misura la trasmissione
energetica all'interno della molecola da un livello energetico più alto ad
uno inferiore, rilevando la radiazione emessa piuttosto che quella
assorbita.
Il principale vantaggio dell'utilizzo della fluorescenza rispetto alle
misure di assorbimento è la maggiore sensibilità dal momento che il segnale
di fluorescenza parte da un background pari a 0. Le applicazioni analitiche
includono misurazioni quantitative di molecole in soluzione e l'impiego in
cromatografie liquide.
Affinché vi sia fluorescenza la molecola deve essere "eccitata" mediante
l'assorbimento di luce di lunghezza d'onda minore (cioè a maggiore energia)
rispetto a quella emessa ( a minore energia). La differenza tra questi due
lambda è nota come shift di Stokes ed i generale i migliori risultati sono
ottenuti con quei composti che presentano degli spostamenti molto ampi. È
possibile anche che un composto assorba nell'ultravioletto ed emetta nel
visibile.
Molte molecole organiche assorbono nel visibile e nell'U.V. ma solo poche di
esse sono fluorescenti. Tuttavia molte di queste sono di interesse
biologico. Gruppi fluorescenti nelle proteine sono:Trp, Tyr, Phe.
La fosforescenza è un fenomeno associato alla fluorescenza ma ha tempi di
decadimento maggiori ed in genere permane anche quando l'energia di
eccitazione non è più applicata.
Si definisce efficienza quantica: Q= quanti emessi/quanti assorbiti
e a basse concentrazioni (<10-5M) è valida la legge: If= k 2.3 I0 ?? c d Q
dove If=intensità di fluorescenza, I0= intensità radiazione incidente,
??=coefficiente di estinzione molare alla lunghezza di assorbimento,
c=concentrazione, d=cammino ottico, k= fattore geometrico strumentale
La relazione mostra che l'intensità della fluorescenza è linearmente
proporzionale alla concentrazione dell'analita.
Determinare la concentrazione dalla fluorescenza emessa da un campione
richiede la calibrazione del fluorimetro con uno standard (per determinare k
e Q) o l'impiego di una curva di lavoro.
Il fluorimetro
Un tipico fluorimetro contiene una sorgente d'eccitazione, una cella per il
campione, un rilevatore. Le molecole in soluzione sono normalmente eccitate
da raggi UV e la sorgente d'eccitazione è una lampada di deuterio o xenon.
La luce proveniente dalla lampada passa attraverso un monocromatore. La
fluorescenza viene dispersa da un'altro monocromatore e rivelata da un tubo
fotomoltiplicatore.
Molte molecole organiche assorbono nel visibile e nell'U.V. ma solo poche di
esse sono fluorescenti. Tuttavia molte di queste sono di interesse
biologico. Gruppi fluorescenti nelle proteine sono:Trp, Tyr, Phe.
La fosforescenza è un fenomeno associato alla fluorescenza ma ha tempi di
decadimento maggiori ed in genere permane anche quando l'energia di
eccitazione non è più applicata.
Si definisce efficienza quantica: Q= quanti emessi/quanti assorbiti
e a basse concentrazioni (<10-5M) è valida la legge: If= k 2.3 I0 ?? c d Q
dove If=intensità di fluorescenza, I0= intensità radiazione incidente,
??=coefficiente di estinzione molare alla lunghezza di assorbimento,
c=concentrazione, d=cammino ottico, k= fattore geometrico strumentale
La relazione mostra che l'intensità della fluorescenza è linearmente
proporzionale alla concentrazione dell'analita.
Determinare la concentrazione dalla fluorescenza emessa da un campione
richiede la calibrazione del fluorimetro con uno standard (per determinare k
e Q) o l'impiego di una curva di lavoro.
Lo spettrofotometro - la spettrofotometria nell'ultravioletto e nel
visibile
L1 ed L2 sono le due sorgenti luminose, una lampada ad idrogeno o deuterio
per l'ultravioletto ed una al tungsteno per il visibile.
Nella figura i raggi vengono convogliati da delle lenti, ma negli strumenti
più moderni si preferiscono gli specchi perchè meno costosi e perchè si ha
minor perdita di radiazione.
M è il monocromatore che consente, partendo da una sorgente di radiazione
policromatica, di ottenere un fascio di radiazione monocromatica e
parallela: in teoria una radiazione composta da una sola lunghezza d'onda.
Il monocromatore può essere un prisma come in figura o un reticolo di
diffrazione.
F1 ed F2 sono due fenditure che contribuiscono ad ottenere una luce
monocromatica.
S è la slitta che porta gli alloggiamenti per le cuvette nelle quali viene
posto il campione da analizzare.
V è la cella fotoelettrica. La spettrofotometria si basa infatti sul fatto
che il potenziale in una cella fotoelettrica è proporzionale all'intensità
della radiazione che arriva alla fotocella stessa. Le fotocelle convertono i
quanti della radiazione luminosa in energia elettrica che può poi essere
amplificata, rilevata e registrata.
a.. quando si lavora nell'ultravioletto si devono utilizzare cuvette di
quarzo o di silice perchè sono trasparenti a lunghezze d'onda superiori ai
180 nm
a.. quando invece si lavora nel visibile si possono utilizzare quelle di
vetro o plastica poichè assorbono le radiazioni al di sotto dei 340 nm.
a.. affinchè la misura sia accurata si deve sempre verificare che le due
cuvette appartengano alla stessa serie ottica.
a.. per tarare lo strumento a zero di estinzione bisogna predisporre una
cuvetta di riferimento otticamente identica a quella di misura e con il
medesimo solvente.
a..
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