Aiuto!Footprinting/Emsa
bebopjoe
farò qualche errore o non rispetterò pienamente la netiquette.
Sono una studentessa di biologia e vorrei sapere le differenze tra due
tecniche impiegate per lo studio dell'interazione DNA/proteine: footprinting
ed emsa/band shift.Cosa si mette in luce con le due tecniche?qual è
l'indagine + sofisticata? Spero di essere stata abbastanza chiara.
Grazie
Elisa Rossi
Sandrokan
> Ciao a tutti! E' la prima volta che scrivo su un NG, quindi perdonatemi se
> faro' qualche errore o non rispettero' pienamente la netiquette.
> Sono una studentessa di biologia e vorrei sapere le differenze tra due
> tecniche impiegate per lo studio dell'interazione DNA/proteine: footprinting
> l'indagine + sofisticata? Spero di essere stata abbastanza chiara.
> Grazie
> Elisa Rossi
FOOTPRINTING
Server per vedere qual'e' la porzione di DNA che viene legata da una certa
proteina.
Il DNA ovviamente e' a doppia elica...
Tu marchi uno dei due filamenti (ad esempio aggiungi un fosfato radioattivo
in 5' su uno dei due filamenti)
Poi prendi il DNA marcato cosi' ottenuto e lo fai interagire con la
proteina. La proteina si lega al DNA su una sequenza specifica e lo copre.
Poi tratti il DNA con la DNAsi I in condizioni blande in modo che tagli una
volta sola su ogni filamento. La parte di DNA coperta dalla proteina
ovviamente non potra' essere tagliata!
Poi fai una elettroforesi in gel di acrilamide in condizioni denaturanti (
ci metti urea ad esempio). Poi fai autoradiografia.
Vedi tutta una serie di bande tranne nella zona coperta! Cosi' riesci a
scoprire qual'era la zona coperta, quanto e' grande e dove si trova!
Tutte le bande si formano per questo motivo:
Tu hai il DNA marcato in 5'. Se tu tagli tanti filamenti uguali di DNA in
piu' punti ovviamente questo si accorcia! Piu' si accorcia e piu' migrera'
nel gel.
Quindi se tagli il filamento subito dopo la prima base avrai un solo
nucleotide marcato e quindi andra' in fondo al gel! Se invece il taglio
avviene a livello del secondo nucleotide questo dinucleotide formato si
andra' a sistemare nel gel subito sopra il mononucleotide .. e cosi' via!
(lo stesso avviene con il sequenziamento di Sanger).
La parte coperta ovviamente non potendo essere tagliata provochera' una
specie di "buco" tra tutte le minibande di DNA che si vengono a formare.
in questom odo riesci a vedere dopo quanti nucleotidi a partire dal 5'
inizia la zona coperta.. e poi ovviamente sequenziando il dna magari con
Sanger si riesce a vedere pure la sequenza.
BANDSHIFT
Questa tecnica serve per trovare quali proteine interagiscono col DNA e per
vedere se queste proteine reagiscono col DNA in quanto tale o se riconoscono
una sequenza specifica.
Praticamente fai un gel di elettroforesi con piu' pozzetti.
Nel primo pozzetto ci metti DNA marcato e un estratto proteico.
In questo modo se fai l'elettroforesi dovresti avere due bande.. la banda
piu' ritardata e' quella del DNA legato alla proteina... la banda piu'
veloce invece e' quella del dna marcato che non si lega alle proteine.
Ora il problema e' vedere se le proteine che hanno legato il DNA riconoscono
una sequenza specifica oppure no.
Nel secondo pozzetto metti quindi il DNA marcato, del DNA qualsiasi non
marcato e l'estratto proteico.
Se la proteina riconosce DNA come tale si leghera' anche al DNA non marcato
e quindi la banda ritardata sara' poco visibile (o non visibile) mentre se
la proteina riconosce il DNA che avevi marcato vuol dire che riconosce una
certa sequenza specifica.
Nel terzo pozzetto come controllo puoi mettere il DNA marcato e basta cosi'
vedi dove si forma la banda.
In questo modo riesci a recuperare ad esempio i fattori trascrizionali. Poi
magari col footprinting riesci a vedere esattamente che sequenza
riconoscono.
Diciamo che il footprinting e' piu' specifico e accurato ma ovviamente
quando si fa una indagine di questo tipo credo che sia meglio utilizzare
entrambe le tecniche!
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,','"_:./\/\,'_ `.`. Sandro Altamura ,','"_:./\/\,'_ `.`.
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