Realtime PCR

[Gainover]

编辑本段Realtime PCR(实时定量PCR)
　　定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied
Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自
动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变
化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应
用于分子生物学研究的各个领域。
　　实时荧光定量PCR 技术的主要应用：
　　1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等
　　2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异
以及cDNA 芯片或差显结果的确证
　　3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等
　　Realtime PCR 常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）
　　SYBR green
　　在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发
射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
　　此方法适用：
　　1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上
　　2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。
　　3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。
　　4、高通量大规模的定量PCR检测
　　5、专一性要求不高的定量PCR检测。
　　Taqman Probe
　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，
报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监
测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
　　此方法适用：
　　1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。
　　2、适用于扩增序列专一的体系的检测。
　　3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。
　　4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。
　　5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。
　　6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。
　　（来源：GENELIFE Biotech 基莱生物）