酵母双杂交的具体过程是什么

[Gainover]

菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa，trp1．
901，leu2—3，112，ura3-52，his3-200，gal4A，gal8O~X，
LYS2：：G地1U^s-GALlT^T^-HIS3， G U^s—GAI2T^T^-
ADE2，URA3：：h吐1U^s．h吐1T^T^．1acZ)，YM187酵母
菌株(NATQ，um3-52，his3-200，ade2—101，trpl-901，
leu2-3，112，g △，met， O△，URA3：：GAL1U^s-
GAL1T^T^一laeZ，NE!,1)．I~BKT7-p53是编码鼠p53蛋
白(a．a．72—390)和GAL4 DNA BD(a．a．1—147)融合
蛋白的阳性对照质粒。pcArrr7．T是编码SV40大T
抗原(a．a．87—7O8)和GAL4 DNA．BD(a．a．1—147)融
合蛋白的阳性对照质粒，上述菌株与质粒均购自
CLONTECH公司。JIVl109大肠杆菌菌株购自promega
公司。
1．2 试剂鲑鱼精担体DNA，酵母培养用的YPD
Medium SD Minimal medium 一 DO Supplement 一Leu
DO Supplement、一Leu／一Trp DO Supplement、一Leu／Trp／His
DO Supplement、一Ade／一His／一L~aTrp 130 Supplement等
均购自CLONTECH。硫酸腺嘌呤(Adenine hemisul。
fate)购自Gibco。PEG 3250购自Sigma。DMSO购自
AMRESCO。硝酸纤维素膜购自Phamacia。X-Gal购
自BBI。QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司，其
它常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司。
1．3 pGBKT7．ps3和t~alrr7．T质粒的制备用2
mL LB液体培养基扩增pGBKT7一p53和pGADT7一T质
粒。分别用小规模碱裂解法【7 (AIK法)和QtarREP
Miniprep Kit试剂盒(QIAGEN法)提取质粒。紫外分
光光度法测0D260／280，并计算质粒DNA含量。
1．4 酵母双杂交共转化实验按酵母操作手册
建议的方法进行转化，取不同量的上述两种方法提
取的pGBKT7—053和pGADT7．T质粒共转化到AH109
酵母菌株中，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
10003种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／
Trp／一Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu)。计算共转化效率：转化效率cfu／／．tg DNA=cfu
×悬浮细胞体积( )×稀释倍数／[铺板体积( )×
DAN‘](*这里的DNA的量指的是所用一份的
质粒量而非全部质粒总量)。
1．5 酵母双杂交顺序转化实验取不同量的上述
两种方法提取的pGBKT7—053转化于AH109酵母菌
株，用SD／ TW缺陷培养基筛选得到AH109[pGBKT7—
53]，挑取新鲜的直径为2—3 iran的AH109[pGBKT7一
p53]酵母单克隆4—8个，接种于1 ml SD／一Trp缺陷
液体培养基中，旋涡振荡1 mira，彻底打散菌团。将1
IIll菌液转移到5O IIll的sD液体缺陷培养基中。将
pGADT7一T转化于AH109[pGBKTT-53]，其余方法同
酵母操作手册，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
1000三种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／一
Trp／．Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu)。按上述公式计算转化效率。
1．6 酵母双杂交交配实验 将pGBKT~．p53和
pGADTrT质粒分别转化于酵母菌株AH109和
YM187中，待在相应SD缺陷培养基平板上生长出
克隆后，分别各挑取一个2—3 nl／n酵母单克隆共放
置于一个含有0．5 ml YPDA液体培养基的1O IIll离
心管中，涡流震荡1 min，彻底打散菌团，3ocI=、200rpm过夜培养(20—24 h)。100 交配培养物铺于
SD／一 一Leu培养基平板，200 交配培养物铺于
SD／一His／一I~u／Tw(TDO )培养基平板。检测二倍体数
目：将交配产物按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓
度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板。待长
出克隆后计数cfu。计算二倍体细胞数目：cfu×悬
浮细胞体积(ta)×稀释倍数／铺板体积(ta)。
1．7 窖a1分析实验
1．7．1 8一半乳糖苷酶的定性分析 检测AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，挑
酵母克隆(新鲜直径为2—3 mm)划双斜线于平铺在
相应培养基平板上的灭菌的硝酸纤维素膜上，3ocI=
倒置培养24小时。将膜于液氮中冷冻，冷冻时间分
别为10 s、30 s、1 rain、2 rain，30cI=放置10 mill，置于浸
没于Z bufer／X．gal(100 ml Z bufer、0．27 ml f≥I巯基乙
醇、1．67 ml 20 mg／m~的X—ga1)溶液的滤纸上(z bufedX．
gal溶液以刚刚浸湿滤纸为佳)，放置于3OcI=下
进行观察，15 rain记录一次，以后可每隔1 h记录一
次。观察不同条件下菌落的颜色变化，划线的酵母
菌落颜色在8 h内显色变蓝的即为阳性结果。同时
没定液氮冷冻时间为1 min，比较处于不同显色温度
(25℃、30℃、37℃)下f；-半乳糖苷酶的活性。
1．7．2 8一半乳糖苷酶的定量分析定量分析AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，同
时以AH109[pCL1]为阳性对照，AH109[pGBKT7—053
+pG~rr7一T]和AH109[pGBKT~+pGADT~一T]为空载
体对照，AH109为阴性对照。AH109[pCL1]的稀释
倍数为3，其余的稀释倍数为1。具体步骤参照酵母
操作手册。计算p半乳糖苷酶的单位：1000×OD∞／
(t×V×ODao)，其中t为反应时间，V=0．1 ml×稀
释倍数。
参考资料：酵母双杂交技术的影响因素及其实验策略

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酵母双杂交系统
　　双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 80年代的工作表明, 转录激活因
子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA
binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能
所必需的。 单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 如
酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。
　　Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。 他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的
DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。 由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或
靶蛋白(prey or target protein)。 如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD
就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。 这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因
(reporter gene)。 通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。 在此
Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。 这个改造过的
LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。 而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失, 从而排除了细胞
内源调控因子的影响。 已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。 结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半
乳糖苷酶活性, 单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。
　　目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。 这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等
做了一些改进。 其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3基因。 经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被
启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。 HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。 大多数双杂交系统往往同时
使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是 LacZ。 这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如
上述的Gal4蛋白)激活。 通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。 其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改
进, 这里不一一详述。
　　在双杂交鉴定过程中要经过两次转化, 这个工作量是相当大的, 特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。 而且, 酵母细胞的转化效率比细菌要低
约4个数量级。 因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。 Bendixen等人通过酵母接合型的引用, 避免了两次转化操作, 同时又提高了双杂交的效
率。 在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型： a接合型和α接合型, 这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体, 但a接合型细胞之间
或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。 根据酵母有性生殖的这一特点, 他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞, “诱饵”表达载体转化a接合型细
胞。 然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn), 再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上, 原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细
胞才能在此平板上生长。 单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。 长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活
力进行鉴定。 这项改进不仅简化了实验操作, 而且也提高了双杂交的筛选效率。
　　在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中, 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。 针对实际工作中的这种需要,
Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system)。 这项技术的关键是报道基因URA3的引入。
URA3基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。 该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。
Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。 这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎
物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。 在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。 然而如果目的蛋
白, 即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用, URA3基因不表达, 则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生
长。 通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物, 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB, 但是丧失了同另外一种称为
DP1蛋白的结合能力。 结果得到了体外结合实验的验证。 通过对这些突变蛋白基因的测序, 他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。