酶
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Aug 15, 2008, 11:34:33 PM8/15/08
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高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。
1857年，Pasteur提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
1897年，Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含活细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。
1913年， Michaelis和Menten提出米氏学说--酶促动力学原理。
1926年， Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。
1969年，化学合成核糖核酸酶。
1967-1970年， 从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。
1986年， Cech发现核酶－具有催化功能的RNA（Ribozyme）。
第一节 酶学概论
一、概念
1.酶的生物学意义（大肠杆菌生命周期20分钟）
酶使得生物体内化学反应容易和迅速。
限制性核酸内切酶（限制-修饰）
2.酶是一种生物催化剂
生物催化剂 ：酶 enzyme
核酶 ribozyme
3. Ribozyme（具有催化功能的RNA）
1980以前，生物催化剂化学本质是蛋白质。
80年代初，Thomas Cech和Sidney Altman发现RNA具有生物催化功能，1989诺贝尔化学奖。
4. 抗体酶 abzyme(antibody enzyme) 又称催化性抗体（catalytic antibody） 是一种具有催化功能的
抗体分子。
过渡态理论：酶与底物在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。
抗体与抗原是基态结合。
二、酶催化反应的特点
1.高催化效率酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍。
2.高专一性酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。
3.反应条件温和 温度低于100℃，正常大气压，中性pH环境。
4.活性可调节别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。
5.有辅酶、辅基、金属离子参与。
与非酶催化剂相比的几点共性：
A. 催化效率高，用量少（细胞中含量低）。
B. 不改变化学反应平衡点。
C. 降低反应活化能。
D. 反应前后自身结构不变。
催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行。催化剂的效应只反映在动力学上，不影响反应的热力学
三、酶的化学本质
经典概念：酶是具有催化功能的蛋白质。
1.酶的组成
仅由蛋白质组成的酶：脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。
酶蛋白+辅助因子（全酶）：超氧化物歧化酶（Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）。
酶的专一性由酶蛋白的结构决定，辅助因子决定反应类型（传递电子或某些化学基团）
2.酶的辅助因子
主要有金属离子（Fe2+、Fe3+ 、Cu+、Cu2+、Mn2+、、Mn3+、Zn2+、Mg2+ 、K+、 Na
+ 、Mo6+ 、Co2+等）和有机化合物。
辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。
辅基：与酶蛋白结合较紧。
酶 辅助因子
CuZn-SOD Cu2+ Zn2+
Mn-SOD Mn2+
过氧化物酶 Fe2+或Fe3+
II型限制性核酸内切酶 Mg2+
羧肽酶 Zn2+
酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。
NAD+构成各种专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。
生物体内酶种类很多，辅助因子种类很少，一种辅助因子可与多种酶蛋白结合。
四、酶按照亚基组成及结构特点分类
单体酶、寡聚酶、多酶复合体
1.单体酶
由一条或多条共价相连的肽链组成的酶。
牛胰RNase 124 单链
鸡卵清溶菌酶 129 单链
胰凝乳蛋白酶 三条肽链
单体酶种类较少，一般多催化水解反应。
2.寡聚酶
由两个或两个以上亚基组成的酶。
A.含相同亚基的寡聚酶
苹果酸脱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基。
B.含不同亚基的寡聚酶
琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基。
大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。
3.多酶复合体
两种以上的酶靠非共价键结合而成。其中每一种酶催化一个反应，反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。
大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体：
丙酮酸脱氢酶（E1） 2×96000
二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000
二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 2×56000
12个E1 二聚体 24×96000
24个E2 单体 24×70000
6个E3 二聚体 12×56000
总分子量：560万
五、酶的活性中心
酶分子上只有少数氨基酸残基与催化活性直接相关，这些与酶活性相关的区域称为酶的活性中心，又称活性部位。
这些残基往往分散在相距较远的顺序中，有的甚至分散在不同的肽链上，靠形成分子空间结构，集中在酶分子特定区域，成为具有催化功能的活性中心。
第二节 酶的命名及分类
一、习惯命名
1.根据底物命名（绝大多数酶）蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶
2.根据催化反应的性质命名水解酶、转氨酶
3.结合上述两个原则命名 琥珀酸脱氢酶
4.有时加上酶的来源 胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶
二、国际系统命名 明确标明酶的全部底物及催化反应的性质。
草酸氧化酶的系统名称：草酸：氧氧化酶
谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶
三、国际系统分类法及编号（EC编号）
乳酸：NAD+氧化还原酶 EC1.1.1.27酶的EC编号由4个数字组成，中间以"*"隔开。
A.反应性质分六类，用1、2、3、4、5、6表示。
B.底物中被作用的基团或键－亚类
C.亚类又可分为若干个亚-亚类
第一个数字表示大类，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示在亚-亚中的编号
1.氧化还原酶类
催化氧化还原反应： A*2H + B = A + B*2H
乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27）
习惯名：乳酸脱氢酶
2.转移酶类
催化基团转移反应： AB + C = A + BC
Ala：酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2）
习惯名：谷丙转氨酶
3.水解酶类
催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1）
习惯名：Ile氨肽酶
4.裂合酶类（裂解酶）
催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。
二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7）
习惯名：醛缩酶
5.异构酶（EC5.3.1.9）
催化同分异构体相互转化。
6-磷酸Glc异构酶
6.合成酶（连接酶）
催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。
UTP：氨连接酶（CTP合成酶）
L-酪氨酸：tRNA连接酶（酪氨酰tRNA合成酶）
T4DNA连接酶
乙醇脱氢酶 EC1.1.1.1
乳酸脱氢酶 EC1.1.1.27
苹果酸脱氢酶 EC1.1.1.37
第一个数字－大类：氧化还原
第二个数字－反应基团：醇基
第三个数字－电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字－酶的底物：乙醇、乳酸、苹果酸。
国际分类不考虑酶的物种差异和组织差异。
SOD： EC1.15.1.1，只有一个名称和编号
2O2-+2H+→H2O2+O2
三类不同的SOD：
CuZn-SOD 真核生物细胞质中
Mn-SOD 真核生物线粒体中
Fe-SOD
同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构有很大不同。
在讨论一个具体的酶时，应说明它的来源。
第三节 酶动力学
酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。
一、酶的量度
用酶的活力单位表示。
1.酶活力与酶促反应速度
酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度。
酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。
2. 酶的活力单位（U）
标准单位：在特定条件下，1分钟内转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。
特定条件：25℃，pH及底物浓度采用最适条件。
实际工作中，每一种酶的测活方法不同，对酶单位分别有一个明确的定义。
限制性核酸内切酶的3种定义：
用粘度法测活性：30℃，1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
转化率法：5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
3. 酶的比活力 Specific activity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
单位：U/mg蛋白质。
酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。
分离纯化一个酶（4 步）
步骤： 1 2 3 4
总活力（U） 6 4 3 2
总蛋白质（mg） 20 10 5 2
比活力（U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2
酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。
酶的纯化倍数：
4. 酶的转换数和催化周期 转换数：每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。
转换数的倒数是催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。
乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，它的催化周期是10-3秒。
二、底物浓度对酶促反应速度的影响（单底物酶促反应）
单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。
1913年Michaelis和Menten提出米－曼方程。
1．底物浓度对反应速度的影响
2. 稳态平衡假说推导米式方程
稳态平衡假说：
A． [S]>> [Et]， Et完全形成ES时， [S] 几乎不变。
B. 只考虑初速度，S消耗极少，P生成极少。
E + P ES忽略不计。
C. ES极快达到平衡，ES的生成速度等于分解速度。
稳态假说推导米式方程
ES生成速度：k1[E][S]
ES分解速度：k2[ES]+k3[ES]
以上两个速度相等:
k1[E][S] = k2[ES]+k3[ES] （1）
[E] = [Et]- [ES] （2）
v = k3 [ES] （3）
Vmax = k3 [Et] （4）
反应速度
Km称米氏常数。
当Km及Vmax已知时，即可确定酶催化反应速度与底物浓度的关系。
3. 米氏方程讨论
①Km的意义
当酶促反应速度v=1/2 Vmax时，[S]=Km 。当酶促反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。
Km是酶的特征常数之一。
Km一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。不同的酶Km值不同。
②Km可表示酶与底物的亲和力
如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km，其中Km最小的底物称该酶的最适底物或一天然底物。
Km愈小（达到Vmax一半所需底物浓度愈小）表示底物与酶的亲和力愈大。
③相对速度（酶活性中心被占据分数Ys）
当v=Vmax时，v与[S]无关，只和[Et]成正比，这表明酶的活性部位已全部被底物占据，当v=1/2 Vmax时，表示活性部位有一
半被占据。
当一个Enzyme的Km已知，则任何底物浓度下酶活性部位的被占据分数。
④米氏方程所作曲线的曲度，不随Km和Vmax变化而变化。因此任何米氏酶，到达任何两个特定Vmax分数时，对应底物浓度之比为常数。
设达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9
0.9Vmax→[S]0.9
0.9Vmax=
0.9Km+0.9[S]0.9=[S]0.9
[S]0.9=9Km
同理有： [S]0.8=4Km
[S]0.7=2.33Km
[S]0.6=1.5Km
[S]0.5=1Km
[S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81
[S]0.7 /[S]0.1=21
0.9Km+0.9[S]0.9=[S]0.9
[S]0.9=9Km
4. Km和Vmax的求解方法
双倒数作图法
5. 多底物酶促反应
米--曼方程适用于单底物酶促反应，如异构、水解及部分裂合反应，不适用于多底物反应
三、pH对酶促反应速度的影响
1.pH影响酶活力的因素
A.影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。
B.影响酶分子中一些基团解离状态，尤其是酶活性中心残基的解离状态，最终影响ES形成。
C.影响底物分子中一些基团解离。
2．酶的最适pH
使酶促反应速度达到最大时的介质pH。大部分酶的pH活性曲线是钟罩形，
也有半钟罩形甚至直线形。
四、温度对酶促反应速度的影响
1．最适温度及影响因素（两个方面）
①加快反应速度 ②酶变性失活
温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，Q10一般为1－2。
温血动物体内的酶，最适温度35℃--40℃，植物体内的酶，最适温度40℃--50℃，细菌Taq DNA聚合酶70℃。
2.酶的稳定性温度
在一定条件、一定时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。
稳定性温度范围的确定方法。
酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。
酶的保存：
①液体酶制剂可以利用上述因素中的几种。
②酶干粉可在室温下放置一段时间，长期保存，应在低温冰箱中。
五、酶浓度对酶促反应速度的影响
如果底物浓度足够大，使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。
Vmax = K3 [E]
[S]过量且不变时，v∝[E]
六、激活剂对酶促反应速度的影响
凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。
提高酶活性：使酶活性进一步提高，离子或简单有机化合物。
激活酶原：无活性→有活性，离子或蛋白质。
1. 无机离子的激活作用
金属离子K+ 、Na+、Ca2+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+
阴离子Cl-、Br -
氢离子
A. 不同离子激活不同的酶。
B. 不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+，但有些可替代，例如 Mg+与Zn+。
C. 浓度适中，过高有抑制作用，1~50mM。
2.简单有机分子的激活作用
A.还原剂（还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有-SH的酶。
B.金属螯合剂（EDTA）能去除重金属离子，解除抑制作用。
七、抑制剂对酶促反应速度的影响
抑制作用：酶活力下降，但酶蛋白不变性。
应用
A.抑制剂型药物。
B.调控生物体的代谢途径，控制发酵。
C.研究酶的活性中心化学基团的功能，化学修饰酶。
（一）不可逆抑制作用
抑制剂与酶活性中心基团共价结合，使酶的活性下降，不能用透析法去除抑制剂。
1.非专一性不可逆抑制剂
酶分子的全部敏感基团
A. 有机磷
二异丙基磷酰氟酯（DFP）和许多有机磷农药。
与酶Ser的－OH结合（含活性中心），抑制某些蛋白酶及酯酶。
作用机理：抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱脂酶，乙酰胆碱积累，神经系统过度兴奋
B.有机汞、有机砷
许多有机汞、有机砷都是烷化剂，可以使酶的巯基烷化，还能与还原型硫辛酸反应。
可以加入过量的巯基化合物解除抑制。
半胱氨酸、GSH和巯基丙醇。
C.氰化物
与含铁扑啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。
D.重金属
Ag、Cu、Hg、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除抑制。
E.青霉素
与糖肽转氨酶的Ser－OH结合，抑制细菌细胞壁合成。
2.专一性不可逆抑制剂
此类抑制剂只与酶活性中心的特定基团反应。
A.Ks型专一性不可逆抑制剂（亲和修饰剂）
具有与底物相似结构，可以与酶特异结合，还有一个能与酶活性中心必须基团反应的活泼基团。
B. Kcat型专一性不可逆抑制剂（自杀性底物）
与底物结构类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应。
潜伏反应基团（latent reactive group）被酶催化而活化，并立即与酶活性中心的必须基团进行不可逆结合，使酶受到抑
制。
（二）可逆抑制作用 Reversible Inhibition
抑制剂与酶蛋白结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性。
1.竞争性抑制（Competitive inhibition）
底物的结构类似物竞争酶的活性中心，与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。
增加底物浓度可以解除此种抑制。
磺胺类药物的抗菌机理：对氨基苯磺酰胺是对氨基苯甲酸的类似物，
竞争性抑制二氢叶酸合成酶的活性。
2.非竞争性抑制
抑制剂与酶活性中心以外的基团结合，其结构可能与底物无关。
酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是中间产物ESI不能生成产物，降低了酶的活性。
不能通过增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。
3. 反竞争性抑制
酶只在与底物结合后，才与抑制剂结合。
E+S→ES+I ≠ P
（三）可逆抑制作用的动力学
1.竞争性抑制
[Et]=[E]+[ES]+[EI]
动力学方程
图 竞争性抑制曲线
竞争性抑制作用
（1） Vmax不变，Km变大。
（2） 抑制程度取决于[I]、[S]、Km和Ki
A. [I]不变，增加[S]，减小抑制程度。
B. [S]不变，增加[I]，增大抑制程度。
C. [I]和[S]不变，Ki越大，抑制作用越小。
D. [I]和[S]不变，Km值越低，抑制程度越小。
E. [I]=Ki时，双倒数图中直线的斜率加倍
非竞争性抑制
[Et] = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]
动力学方程
图 非竞争性抑制曲线
非竞争性抑制
（1） Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）。
（2）抑制程度去决于[I]和Ki ，与酶的Km和[S] 无关。
（3）定[I]和[S]不变， Ki越大，抑制作用越小。
3. 反竞争性抑制
[Et] = [E] + [ES] + [ESI]
动力学方程
图 反竞争抑制曲线
反竞争性抑制
（1）Km及Vmax都变小。
（2）双倒数方程的斜率不变。
第四节 酶的作用机理
一、专一性的机理
（一）酶专一性类型
1. 结构专一性 Specificity
（1）键专一性 限制键，不限制键两侧基团。
脂酶：R1－CO－OR2
（2）基团专一性 限制键，还限制键一端的基团，但不限制键另一端的基团。
α--D--Glc苷酶，水解蔗糖和麦芽糖。
（3）绝对专一性 只能催化一个底物，麦芽糖酶只催化麦芽糖水解，脲酶只催化尿素水解。
2. 立体异构专一性
（1）旋光异构专一性 Glu脱氢酶只催化L－Glu，乳酸脱氢酶只催化L－乳酸。
（2）几何异构专一性 反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成苹果酸。
立体化学专一性还表现在酶能催化对称分子中等同的两个基团中的一个，而对另一个无作用。
顺-乌头酸酶只催化柠檬酸两个-CH2COOH中的一个。
（二）酶专一性的解释
1.三点结合及锁钥模型（刚性模板假说）
酶活性中心的形状与底物分子形状互补。
底物分子或其一部分像钥匙一样，专一的插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶底物复合物。
酶活性中心的催化基团正好对准底物的敏感键，进行催化反应。
2.诱导楔合模型
酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物互补楔合，进行反应。
二、高效性的机理
1. 邻近效应与定向效应
酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近。同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于
发生。
对反应速度的影响
①使底物浓度在活性中心附近很高。
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用。
③酶使分子间反应转变成分子内反应。
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
2. 扭曲变形和构象变化的催化效应
酶分子中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力。
①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。
②底物扭曲、变形，利于形成ES复合物。
③底物构象变化，变得更接近过度态结构，大大降低活化能。
3. 共价催化
酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。
4. 酸碱催化
酶分子的一些功能基团起质子供体或质子受体的作用。
影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度 His咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵咪唑基给出质子或结合质子的速度最快。
5. 金属离子催化
6. 多元催化和协同效应
7. 活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子。
三、酶作用机理举例
1.胰凝乳蛋白酶的作用机理
（1）专一性
该酶需要底物有一个疏水基团，定位结合于酶上的疏水部位，使底物敏感键对准酶的催化基团。
疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp
三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部位 p408
胰凝乳蛋白酶--芳香环、大的非极性脂肪族侧链胰蛋白酶--带正电荷的Lys、Arg进入弹性蛋白酶--Ala等小分子非极性侧链进入
（2）催化机理 p410
① 活性中心-催化三联体
Asp102--His57--Ser195氢键体系。
His57的咪唑基桥梁。
通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。
Ser195成为亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。
第五节 多酶体系与酶活性的调节控制
一、多酶体系
1.多酶体系及其分类
多酶体系：在完整的细胞内，某一代谢途径由几个酶组成的反应链体系。
可溶性的（分散的）结构化的（多酶复合体）在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）
2.多酶体系的调节
（1）第一步反应往往是限速步骤，控制着整个反应速度。
（2）反馈抑制与底物激活催化第一步反酶，大应的多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制。有时反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反
馈抑制，有的被底物激活。
二、酶活性的调节
调节酶：活性可被调节的酶，主要有别构酶和共价调节酶。
（一） 别构调节 Allosteric regulation
酶分子的非催化部位与某些化合物非共价结合变化后构象，从而改变的酶活性。
别构效应物、别构剂，正效应物、负效应物
1. 别构酶的结构特点和性质
（1）别构酶一般是寡聚酶
（2）别构酶具有协同效应，正协同－S曲线，负协同－双曲线。
（3）K型效应和V型效应
K型效应－改变K0.5而不改变Vmax的效应
V型效应－改变Vmax而不改变K0.5的效应
（4）加热脱敏，无调节活性，同米氏酶。
2.别构酶的动力学曲线
（1）正协同效应的别构酶是S型曲线
当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1= 81
别构酶：[S]0.9/[S]0.1= 3
表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax。
（2）负协同效应的别构酶是近似双曲线
负协同效应的酶，反应速度对底物浓度的化不敏感 。
图 正负协同效应
3.别构酶调节活性的机理
（1）齐变模型（WMC）
（2）序变模型（KNF）
酶分子中亚基结合底物后，构象依次变化。
4.别构酶的鉴定[S]0.9／[S]0.1
Rs = 81 米氏酶
Rs ＜ 81 正协同效应
Rs ＞ 81 负协同效应
Hill系数：[S]0.9／[S]0.1＝ 81
n = 1 米氏酶
n ＞ 1 正协同效应
n ＜ 1 负协同效应
（二）可逆共价修饰调节
共价调节酶：酶分子被其它的酶催化，进行共价修饰，在活性形式与非活性形式之间相互转变。
举例：糖原磷酸化酶
（三）酶原的激活
具有不可逆性。此类酶主要有消化系统中的酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。
1.胰凝乳蛋白酶原的激活被胰蛋白酶激活
2.胰蛋白酶原的激活被肠激酶激活
图 胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的激活
3.消化系统中酶原的激活
（四）专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节
钙调蛋白、激素结合蛋白，促进或抑制特 异的酶活性。
（五） 同工酶
能催化同一种化学反应，但酶蛋白的分子结构不同的一组酶。存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中。
哺乳动物乳酸脱氢酶(LDH)有5种
CH3CHOH-COO-+NAD+ CH3COCOO-+NADH+H+
由H和M二种亚基组成HHHH在心肌中占优势，HHHM，HHMM，HMMM，MMMM在骨骼肌中占优势。
酶组成酶和诱导酶
组成酶：正常细胞内存在的酶，含量较稳定，受外界因素影响小。
诱导酶：正常细胞中含量极少或没有，加入特定诱导物后产生的酶。诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。
例如，大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶。
在含Glc的培养基中。
在只含乳糖的培养基中。
Glc-β(1→4)Gal苷。
第三章 维生素与辅酶
维持生物正常生命过程必需的一类小分子有机化合物。在生物体内含量极少，大多数由食物供给，生物体自身不能合成。
脂溶性: A、D、E、K，单独具有生理功能。
水溶性: B1、B2、B6、B12、C，辅酶。
基本功能: P434 表11－1
第一节 脂溶性维生素
一、维生素A和胡萝卜素
1. 结构
化学名称：视黄醇 retinol
A1: 哺乳动物及咸水鱼
A2: 淡水鱼
2.维生素A的来源
β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、黄玉米色素等在肝脏、肠粘膜内转化成A。
β-胡萝卜素可转化成2个维生素A（有色蔬菜）
α-胡萝卜素
γ-胡萝卜素 转化成一个维生素A
黄玉米色素
3.功能（与视觉有关）
活性形式：11-顺式视黄醛
缺乏症：夜盲症
视紫红质为弱光感受物，当弱光射到视网膜上时，视紫红质分解，并刺激视神经而发生光觉。
11-顺式视黄醛在暗光下经视网膜圆柱细胞作用后，与视蛋白结合成视紫红质，形成一个视循环。
当全反视黄醛变成11-顺式视黄醛时，部分全反视黄醛被分解为无用物质，故必需随时补充维生素A，每日补充量1.0mg。
二、维生素D（D2和D3。）
D2－麦角钙化醇， D3－胆钙化醇。
1.来源
动物体内有维生素D，植物体内一般不含维生素D（但有维生素D原）。
鱼肝油、蛋黄、牛奶、肝、肾、皮肤组织等富含维生素D。
酵母、真菌、植物中：麦角固醇（D2原）
动物体内：7-脱氢胆固醇（D3原）
2.结构
麦角固醇 (R) 维生素D2 （麦角钙化醇）
7-脱氢胆固醇（皮肤）(R) 维生素D3 （胆钙化醇）
3.功能
调节钙磷代谢，维持血中钙磷正常水平，促进骨骼正常生长。
缺乏症：佝偻病
活性形式：1，25-二羟基胆钙醇
维生素D3（胆钙化醇）→25-羟基胆钙醇（肝脏）→1，25-二羟基胆钙醇（肾脏）→小肠（促进Ca2+ 的吸收、运输 ）及骨骼（促进
Ca2+的沉积 ）中，参与调节钙磷代谢。
三、维生素E 化学名称生育酚，共有8种，直接具有活性。
1.结构 α-生育酚
2.来源
动物油、植物油（麦胚油、玉米油、花生油、棉子油）、蛋黄、牛奶、水果等。
3.功能（抗氧剂-抗油脂氧化）
生理功能：抗生殖不育、肌肉委缩、贫血、血细胞形态异常。
机理：有抗氧化活性，能防止不饱和脂肪酸自动氧化，保护细胞膜，延长细胞寿命。还可保护巯基酶的活性。
四、维生素K（ K1、K2、K3）
1.结构
2.来源
食物和肠道微生物合成；绿色蔬菜、动物肝脏、牛奶、大豆；大肠杆菌、乳酸菌。
3.功能－促进凝血
缺乏症：肌肉出血、凝血时间延长凝血过程中，许多凝血因子的生成与维生K有关
①凝血酶原 因子II
②转变加速因子前体 因子VII
③血浆凝血酶激酶 因子IX
④司徒氏因子 因子X
第二节 水溶性维生素与辅酶
主要是B族维生素，绝大多数是辅酶
一、 维生B1与焦磷酸硫胺素（TPP）
化学名称：硫胺素
活性形式：焦磷酸硫胺素（TPP）
1.结构
硫胺素 + ATP TPP + AMP
硫胺素激酶
2.来源 瘦肉、酵母、谷类的胚芽、皮层
3.功能（TPP）
脱羧酶的辅酶
缺乏症：脚气病、多发性神经炎
TPP是催化丙酮酸、α-酮戊二酸脱羧的辅酶。
噻唑环C-2上氢解离，使C-2变成负碳离子，可以与α-酮酸的羧基碳结合，形成中间物脱羧。
二、维生素B2与黄素辅酶（FAD、FMN）
化学名称：核黄素
1.结构
活性形式：
FMN，还原型FMNH2
FAD，还原型FADH2
核黄素+ATP→FMN+ADP
FMN+ATP→FAD+ppi
2.来源
肝脏、酵母、大豆和米糠等
3.功能
FMN、FAD作为氧化还原型辅酶，可分别与酶蛋白结合构成脱氢酶，辅酶传递氢。
酶 底物 产物 辅酶
D-a.a氧化酶 D-a.a α-酮酸 FAD
羟基乙酸氧化酶 羟基乙酸 乙醛酸 FMN
琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 反丁烯二酸 FAD
三、维生素B3－泛酸与辅酶A（CoA）
维生素B3也称泛酸，是辅酶A的组成部分。
1.结构 VB3（泛酸）
2.功能
活性位点：-SH
功能：辅酶A能与乙酰基结合，生成乙酰辅酶A。
乙酰辅酶A是乙酰基的载体，可转运乙酰基。
脂酰基载体，转运脂酰基。
四、维生素B5与烟酰胺辅酶
维生素B5包括烟酸（尼克酸）、烟酰胺（尼克酰胺），烟酰胺是合成NAD、NADP的前体。
NAD、NADP是各种脱氢酶的辅酶。
MH2+NAD+→M+NADH+H+
酶 底物 产物 辅酶
醇脱氢酶 乙醇 乙醛 NAD+
异柠檬酸 异柠檬酸 α-酮戊二酸 NAD+或NADP+
脱氢酶
五、维生素B6与磷酸吡哆醛辅酶
维生素B6包括：吡哆醛、吡哆胺、吡哆醇。
活性形式：磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛。
功能：磷酸吡哆醛转氨酶、磷酸吡哆胺转氨酶
六、生物素与羧化辅酶
化学名称：生物素
生物素的结构
七、维生素B11
维生素B11又名叶酸，喋血谷氨酸。
活性形式：四氢叶酸（THF），传递一碳单位。
传递的一碳单位有：甲基、亚甲基（甲叉）、甲川基、甲酰基、亚胺甲基。
活性位点：N5、N10
八、维生素B12
化学名称：钴胺素。
5'-脱氧腺嘌呤核苷酸钴胺素是甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的辅酶。催化L-甲基丙二酸单酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A。
九、硫辛酸
丙酮酸脱羧酶复合体中的辅酶。
十、维生素C
1.结构
化学名称：抗坏血酸
2.来源 食物
3.功能 抗氧化剂
缺乏症：坏血病、毛细血管脆弱、牙龈发炎出血
Chapter 4 Nucleotides and Nucleic Acids
4.1 Components of Nucleic Acids
一、Base Pyrimidine and Purine
1. Purine Adenine、 Guanine
2. Pyrimidine Cytosine、Uracil、Thymine
3. Modified Base
100余种，多数是甲基化的产物，植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C
二、核苷与脱氧核苷
糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。
核酸中的核苷均为β-型核苷。
三、核苷酸
核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化。
1. 构成DNA、RNA核苷酸
2. 细胞内游离核苷酸及其衍生物
①核苷5'-多磷酸化合物
ATP、GTP、CTP在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。
②环核苷酸
3'、5'-cAMP ; 3'、5'-cGMP激素的第二信使，cAMP调节糖代谢、脂代谢。
③核苷5'多磷酸3'多磷酸化合物ppGpp 、pppGpp、ppApp
④核苷酸衍生物
HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等的辅助因子。
在糖蛋白生物合成中，GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是活性的糖基供体。
4.2 DNA
Primary Structure－Sequence
Secondary Structure－Double Helix
Tertiary Structure－Folding Conformation
一、Primary Structure
dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3',5'-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。
3',5'-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构。
书写方法：5' → 3' 5'-pApCpTpG-3'或5'...ACTG...3' 真正代表DNA生物学意义的是碱基排列顺序。
二、DNA的二级结构
1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA钠盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。
Chargaff 规律（ 1950年）
a. DNA中，A=T，G=C 。（A+G = C+T）
b. DNA碱基组成具有物种的特异性。
c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。
d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。
1. Watson-Crick结构模型（B-DNA）P489
★ 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴缠成右手双股螺旋，一条5'→3'，另一条3'→5'。
★ 嘌呤与嘧啶碱基位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋的外侧。
★ 磷酸与脱氧核糖通过3', 5' -磷酸二酯键连接，构成DNA分子的骨架。
★ 大沟：宽0.2nm ，深0.85nm。小沟：宽0.6nm，深0.75nm。
★ 双螺旋平均直径2.37nm 每圈螺旋含10.4个碱基 碱基堆积距离：0.34nm 螺距：3.32nm
★ 两条核苷酸链，依靠碱基间形成的氢链结合在一起。A=T, G=C
2. 稳定双螺旋结构的因素
①碱基堆积力，形成疏水环境。
②碱基配对的氢键，GC含量越多，越稳定。
③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。
④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性小分子的攻击。
三、DNA二级结构的多型性 A、B、Z-DNA
1. B-DNA 典型的Watson-Crick双螺旋DNA。 右手双股螺旋
2. A-DNA 右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。
3. Z-DNA 左手双螺旋DNA。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。
4. DNA三股螺旋（ H-DNA）和四股螺旋
DNA三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点。
第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。
TAT、C+GC两种碱基配对方式。
四、DNA二级结构的不均一性
1.反向重复序列（回文序列）
DNA序列以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。
较长的回文结构，可形成发夹结构和十字结构，与转录的终止有关。
较短的回文结构往往是限制性核酸内切酶的识别位点。
5-GGTACC-3
3-CCATGG-5
五、环状DNA
某些病毒DNA
某些噬菌体DNA
某些细菌染色体DNA
细菌质粒DNA
真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA
1.环状DNA的不同构象
松驰环 解链环和负超螺旋
（1）松弛环形DNA 线形DNA直接环化。
（2）解链环形DNA 线形DNA拧松后再环化。
（3）正超螺旋与负超螺旋DNA
正超螺旋：线形DNA双链（右手螺旋）一端固定， 另一端向缠紧的方向旋转几圈，再将两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋（ DNA双链间），以解除
外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。
负超螺旋：线形DNA双链（右手螺旋）一端固定，另一端向松弛的方向旋转几圈，再将两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋（ DNA双链间）以解除外加
的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫负超螺旋。
2. 环形DNA的拓扑学特性
以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4 = 25
①连环数（L）
DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。
松驰环：L=25
解链环：L=23
超螺旋：L=23
②缠绕数（T）
DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示
松驰环T = 25
解链环T = 23
超螺旋T = 25
③超螺旋数（扭曲数W）
松驰环W = 0
解链环W = 0
超螺旋W = -2
L = T + W
④比连环差（λ）
表示DNA的超螺旋程度。
λ=（L - L0）/L0
L0是指松驰环形DNA的L值。
天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03---0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。
负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，容易解链，有利于DNA的复制、重组和转录。
3.拓扑异构酶
改变DNA拓扑异构体的L值。
①拓扑异构酶I（拧紧）
能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1。
②拓扑异构酶II（拧松）
能使正超螺旋转变成松驰DNA。每次催化使L减少2。
六、染色体结构
1. 大肠杆菌染色体
大肠杆菌染色体是由4.2×106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。
大肠杆菌DNA结合蛋白： 每个细胞
H 两个28KD的相同亚基 30000个二聚
HU 两个各9KD的不同亚基 40000个二体聚
HLP1 17KD的亚基 20000个单体
P 3KD的亚基 未知
大肠杆菌DNA（ 4.2×106bp ）与结合蛋白压缩成手脚架结构，中心是多种DNA结合蛋白。
DNA上有多个位点与这些蛋白结合，形成约100个小区。每个小区的DNA都是负超螺旋，两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。
用极微量的DNA酶I处理时，只能使少数小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。
2．真核生物染色体（组蛋白和DNA组成）
组蛋白富含碱性氨基酸，根据Lys/Arg比值不同，分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均是单链蛋白质，分子量
11000-21000。
H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成八聚体。
146bp长度的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。核小体间DNA长度15-100bp，其上结合H1。
2H2A、2H2B、2H3、2H4八聚体。
146bp DNA
核小体 串联 染色质 折叠 染色体
DNA（直径2nm）
盘绕组蛋白，结合H1，压缩比1/7
核小体
螺旋化，压缩比1/6
螺线管
再螺旋化，压缩比1/40
超螺线管
折叠，压缩比1/5
染色单体
总压缩比：1/8400~1/10000
4.3 RNA的结构
一、RNA的一级结构
AMP、GMP、CMP、UMP通过3'、5'磷酸二酯键形成的线形多聚体，组成RNA的戊糖是核糖。
RNA的U替代DNA中的T，RNA中常有一些稀有碱基。
天然RNA分子是单链线形分子，部分区域有A-型双螺旋结构。
RNA的类型
核糖体RNA： rRNA
转运 RNA： tRNA
信使 RNA： mRNA
内小RNA： snRNA （small nuclear RNA ）
二、tRNA的结构
70－90b，分子量25kd左右，沉降系数4S左右。有较多稀有碱基。
3'端是...CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。
5'末端大多为pG...或pC...
二级结构是三叶草形。
三、mRNA的结构
1.真核mRNA（P）
（1）3'端有20-250核苷酸的polyA。
polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA其polyA较长；衰老的mRNA其polyA较短。
polyA功能：PolyA是mRNA进入胞质的必需形式。
PolyA提高mRNA在胞质中的稳定性。
（2）5'-帽子
帽子结构： 3'-mG-5'ppp5'-Nm-3'-P
5'末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5'-5'-磷酸二酯键。
功能：抵抗5'核酸外切酶降解mRNA。
为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。
2.原核mRNA
由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5'帽子和3'polyA。
SD序列：5'端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5'-AGGAGGU-3'，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由
Shine和Dalgarno发现，称SD序列。
SD序列和核糖体16S的rRNA的3'末端富含嘧啶碱基的序列互补。
四、rRNA的结构
rRNA与核糖体结合蛋白一起构成核糖体。
大肠杆菌中有三类rRNA（原核）：
5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA
真核细胞有四类rRNA：
5S rRNA、5.8S rRNA、18SrRNA、28S rRNA23S rRNA能够催化肽键的合成。
图 大肠杆菌5S rRNA结构
16 S rRNA
4.4 核酸的性质
一、水解性质
1.碱水解
室温条件下，0.1mol/L NaOH可将RNA完全水解，得到2'-或3'-磷酸核苷的混合物。在相同条件下，DNA不被水解。因为RNA中
C'2-OH的存在，促进磷酸酯键的水解。
DNA稳定---储存和传递遗传信息
mRNA是DNA的信使---完成任务后迅速降解
2.酶水解
RNA水解酶 RNase
DNA水解酶 DNase
核酸外切酶
核酸内切酶 限制性核酸内切酶
二、解离性质
磷酸和碱基能发生两性解离。
DNA等电点 4-4.5
RNA等电点 2-2.5
三、光吸收性
碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有较强的光吸收性，λmax=260nm
1.鉴定纯度
纯DNA：A260/A280 ＝1.8（1.65-1.85）若大于1.8，表示污染了RNA或DNA降解
纯RNA：A260/A280 ＝2.0若有杂蛋白或苯酚，则A260/A280明显降低
2.含量计算
1.0 ABS相当于50ug/mL双螺旋DNA或40ug/mL单链DNA（或RNA）或20ug/mL核苷酸
3.增色效应与减色效应
增色效应：DNA变性时，摩尔吸光系数增大。
减色效应：DNA复性时，摩尔吸光系数减小。
四、沉降特性（DNA）
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速度不同，用CsCl密度梯度离心可密度和沉降速度不同，用CsCl密度梯度离心可以将它们
区分开来。这一方法常用于质粒DNA的分离纯化。
相对沉降常数
线型双螺旋分子 1.00
松驰双链闭环 1.14
切刻双链环 1.14
单链环 1.14
线型单链 1.30
正超或负超螺旋双链环 1.41
坍缩 3.0
图 CsCl密度梯度离心
五、变性与复性
1.变性
核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链。
变性发生在一个很窄的温度范围内。
因素：热、酸碱（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）
现象：吸光度升高，粘度降低，密度升高。二级结构改变，部分失活。
（1）熔解温度（Tm）
DNA双螺旋结构解链50%时的温度浓度50ug/mL时，双链DNA的A260=1.00
完全变性 A260= 1.37
当A260增加到最大增加值一半时（ 1.185 ），对应的温度即为Tm。
DNA的Tm一般在70－85℃之间。
（2）影响DNA Tm值的因素
A.DNA均一性
均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。
B.G-C含量与Tm值成正比
测定Tm，可推知G-C含量。
G-C%=（Tm-69.3）×2.44
C.离子强度
离子强度越高，Tm越高。
2. 复性
变性的DNA在适当（一般低于Tm 20－25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。
缓慢冷却时可以复性，快速冷却时不能复性。
DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。
复性速度可用Co*t衡量。
Co是变性DNA的起始浓度mol*L-1
t是时间（秒）
★1个核苷酸对（AU），若浓度为Co=1.0mmol/L，50%复性时，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部复
性，Cot=10-4， t=0.1秒
★E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，复性50%，Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，115
天。复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，约5758天。
★复性机制：10-20bp成核，拉链。
4.5 核酸研究技术
一、核酸的分离纯化
保持天然状态。
条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。
抑制核酸酶。
1.DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1 mol/L NaCl），不溶于0.14 mol/L的NaCl中。利用此性
质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。
DNA核蛋白可用水饱和酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿-异戊醇去除蛋白质
2.RNA的分离纯化（mRNA的分离、纯化）
用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀， RNA核蛋白（RNP）在上清液中。
去蛋白：盐酸胍、苯酚等。
必须防止RNA酶对RNA的破坏。
二、核酸的凝胶电泳
1.琼脂糖电泳
①核酸分子大小 迁移率与分子量的对数成反比。
②凝胶浓度超螺旋最快，线形其次，松弛环最慢。
③DNA的构象
④ 电压5V/cm
DNA 琼脂糖电泳
2.PAGE电泳
三、限制性核酸内切酶
1. 限制修饰作用
2.II型核酸内切酶
限制、修饰活性分开，单体蛋白，辅助因子Mg2+，位点序列反向重复。
II型酶的切割频率
识别位点： 4 44 = 256
6 46 = 4096
8 48 = 65536
限制酶的命名：E.coRI
第一位属名，大写E
第二、三位种名的头两个字母，小写co
第四位菌株R
第五位从该细菌中分离出来的这一类酶的编号
EcoRI酶切位点
同裂酶：来源不同的限制性核酸内切酶（名称不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。
例1：BamHI GG↓ATCC ，BstI GG↓ATCC
例2：MboI GAT↓C， Sau3A GAT↓C
同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，切割后都产生相同的粘性末端。
例: BclI TG↓ATCA， BglII AG↓ATCA
四、 分子杂交
1. Southern Blotting
Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，可用DNA或RNA探针
五、DNA序列分析
1.化学裂解法
利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一放射性标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸
片段的PAGE上分离。
硫酸二甲酯特异切割：G
甲酸特异切割：G和A
肼在NaCl条件下切割：C
肼在无 NaCl条件下切割：T和C
32P *ACTTCGACAA
硫酸二甲酯（G）： *ACTTC
甲酸（G、A）： *P
*ACTTC
*ACTTCG
*ACTTCGAC
*ACTTCGACA
32P *ACTTCGACAA
肼（NaCl）（C）： *A
*ACTT
*ACTTCGA
肼（无NaCl）（C、T）： *A
*AC
*ACT
*ACTT
*ACTTCGA
图 化学法测定DNA一级结构
2.双脱氧终止法
英国Sanger1955年测定牛胰岛素结构，获诺贝尔化学奖。
1980年设计出DNA测序法，获诺贝尔化学奖。
策略
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
3.杂交测序
在1.6cm2 的芯片上合成48（65536）种8-mer寡核苷酸。
原理:如果一段较短的DNA探针(8)能够同较长的靶DNA片段杂交，并形成完全的双链分子，那么可据此推断在靶DNA上存在着相应的互补序
列。
A.将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交。
B.对那些能够同靶DNA形成完全双链体分子的寡核苷酸探针之间的碱基重叠关系作比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列结构。
例如，将5--AGCCTAGCTGAA--3的12-mer的靶DNA，同一组完全的8-mer的寡核苷酸探针混合杂交。
在这一组由总数为48（65536）种的8-mer寡核苷酸组成的完全的探针群体中，仅有5种会同靶DNA形成完全互补的双链体分子。
根据这5种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶DNA分子的核苷酸顺序。
图 杂交测序-1
图 杂交测序-2
1857年，Pasteur提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
1897年，Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含活细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。
1913年， Michaelis和Menten提出米氏学说--酶促动力学原理。
1926年， Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。
1969年，化学合成核糖核酸酶。
1967-1970年， 从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。
1986年， Cech发现核酶－具有催化功能的RNA（Ribozyme）。
第一节 酶学概论
一、概念
1.酶的生物学意义（大肠杆菌生命周期20分钟）
酶使得生物体内化学反应容易和迅速。
限制性核酸内切酶（限制-修饰）
2.酶是一种生物催化剂
生物催化剂 ：酶 enzyme
核酶 ribozyme
3. Ribozyme（具有催化功能的RNA）
1980以前，生物催化剂化学本质是蛋白质。
80年代初，Thomas Cech和Sidney Altman发现RNA具有生物催化功能，1989诺贝尔化学奖。
4. 抗体酶 abzyme(antibody enzyme) 又称催化性抗体（catalytic antibody） 是一种具有催化功能的
抗体分子。
过渡态理论：酶与底物在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。
抗体与抗原是基态结合。
二、酶催化反应的特点
1.高催化效率酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍。
2.高专一性酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。
3.反应条件温和 温度低于100℃，正常大气压，中性pH环境。
4.活性可调节别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。
5.有辅酶、辅基、金属离子参与。
与非酶催化剂相比的几点共性：
A. 催化效率高，用量少（细胞中含量低）。
B. 不改变化学反应平衡点。
C. 降低反应活化能。
D. 反应前后自身结构不变。
催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行。催化剂的效应只反映在动力学上，不影响反应的热力学
三、酶的化学本质
经典概念：酶是具有催化功能的蛋白质。
1.酶的组成
仅由蛋白质组成的酶：脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。
酶蛋白+辅助因子（全酶）：超氧化物歧化酶（Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）。
酶的专一性由酶蛋白的结构决定，辅助因子决定反应类型（传递电子或某些化学基团）
2.酶的辅助因子
主要有金属离子（Fe2+、Fe3+ 、Cu+、Cu2+、Mn2+、、Mn3+、Zn2+、Mg2+ 、K+、 Na
+ 、Mo6+ 、Co2+等）和有机化合物。
辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。
辅基：与酶蛋白结合较紧。
酶 辅助因子
CuZn-SOD Cu2+ Zn2+
Mn-SOD Mn2+
过氧化物酶 Fe2+或Fe3+
II型限制性核酸内切酶 Mg2+
羧肽酶 Zn2+
酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。
NAD+构成各种专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。
生物体内酶种类很多，辅助因子种类很少，一种辅助因子可与多种酶蛋白结合。
四、酶按照亚基组成及结构特点分类
单体酶、寡聚酶、多酶复合体
1.单体酶
由一条或多条共价相连的肽链组成的酶。
牛胰RNase 124 单链
鸡卵清溶菌酶 129 单链
胰凝乳蛋白酶 三条肽链
单体酶种类较少，一般多催化水解反应。
2.寡聚酶
由两个或两个以上亚基组成的酶。
A.含相同亚基的寡聚酶
苹果酸脱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基。
B.含不同亚基的寡聚酶
琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基。
大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。
3.多酶复合体
两种以上的酶靠非共价键结合而成。其中每一种酶催化一个反应，反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。
大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体：
丙酮酸脱氢酶（E1） 2×96000
二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000
二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 2×56000
12个E1 二聚体 24×96000
24个E2 单体 24×70000
6个E3 二聚体 12×56000
总分子量：560万
五、酶的活性中心
酶分子上只有少数氨基酸残基与催化活性直接相关，这些与酶活性相关的区域称为酶的活性中心，又称活性部位。
这些残基往往分散在相距较远的顺序中，有的甚至分散在不同的肽链上，靠形成分子空间结构，集中在酶分子特定区域，成为具有催化功能的活性中心。
第二节 酶的命名及分类
一、习惯命名
1.根据底物命名（绝大多数酶）蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶
2.根据催化反应的性质命名水解酶、转氨酶
3.结合上述两个原则命名 琥珀酸脱氢酶
4.有时加上酶的来源 胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶
二、国际系统命名 明确标明酶的全部底物及催化反应的性质。
草酸氧化酶的系统名称：草酸：氧氧化酶
谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶
三、国际系统分类法及编号（EC编号）
乳酸：NAD+氧化还原酶 EC1.1.1.27酶的EC编号由4个数字组成，中间以"*"隔开。
A.反应性质分六类，用1、2、3、4、5、6表示。
B.底物中被作用的基团或键－亚类
C.亚类又可分为若干个亚-亚类
第一个数字表示大类，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示在亚-亚中的编号
1.氧化还原酶类
催化氧化还原反应： A*2H + B = A + B*2H
乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27）
习惯名：乳酸脱氢酶
2.转移酶类
催化基团转移反应： AB + C = A + BC
Ala：酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2）
习惯名：谷丙转氨酶
3.水解酶类
催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1）
习惯名：Ile氨肽酶
4.裂合酶类（裂解酶）
催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。
二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7）
习惯名：醛缩酶
5.异构酶（EC5.3.1.9）
催化同分异构体相互转化。
6-磷酸Glc异构酶
6.合成酶（连接酶）
催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。
UTP：氨连接酶（CTP合成酶）
L-酪氨酸：tRNA连接酶（酪氨酰tRNA合成酶）
T4DNA连接酶
乙醇脱氢酶 EC1.1.1.1
乳酸脱氢酶 EC1.1.1.27
苹果酸脱氢酶 EC1.1.1.37
第一个数字－大类：氧化还原
第二个数字－反应基团：醇基
第三个数字－电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字－酶的底物：乙醇、乳酸、苹果酸。
国际分类不考虑酶的物种差异和组织差异。
SOD： EC1.15.1.1，只有一个名称和编号
2O2-+2H+→H2O2+O2
三类不同的SOD：
CuZn-SOD 真核生物细胞质中
Mn-SOD 真核生物线粒体中
Fe-SOD
同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构有很大不同。
在讨论一个具体的酶时，应说明它的来源。
第三节 酶动力学
酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。
一、酶的量度
用酶的活力单位表示。
1.酶活力与酶促反应速度
酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度。
酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。
2. 酶的活力单位（U）
标准单位：在特定条件下，1分钟内转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。
特定条件：25℃，pH及底物浓度采用最适条件。
实际工作中，每一种酶的测活方法不同，对酶单位分别有一个明确的定义。
限制性核酸内切酶的3种定义：
用粘度法测活性：30℃，1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
转化率法：5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
3. 酶的比活力 Specific activity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
单位：U/mg蛋白质。
酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。
分离纯化一个酶（4 步）
步骤： 1 2 3 4
总活力（U） 6 4 3 2
总蛋白质（mg） 20 10 5 2
比活力（U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2
酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。
酶的纯化倍数：
4. 酶的转换数和催化周期 转换数：每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。
转换数的倒数是催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。
乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，它的催化周期是10-3秒。
二、底物浓度对酶促反应速度的影响（单底物酶促反应）
单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。
1913年Michaelis和Menten提出米－曼方程。
1．底物浓度对反应速度的影响
2. 稳态平衡假说推导米式方程
稳态平衡假说：
A． [S]>> [Et]， Et完全形成ES时， [S] 几乎不变。
B. 只考虑初速度，S消耗极少，P生成极少。
E + P ES忽略不计。
C. ES极快达到平衡，ES的生成速度等于分解速度。
稳态假说推导米式方程
ES生成速度：k1[E][S]
ES分解速度：k2[ES]+k3[ES]
以上两个速度相等:
k1[E][S] = k2[ES]+k3[ES] （1）
[E] = [Et]- [ES] （2）
v = k3 [ES] （3）
Vmax = k3 [Et] （4）
反应速度
Km称米氏常数。
当Km及Vmax已知时，即可确定酶催化反应速度与底物浓度的关系。
3. 米氏方程讨论
①Km的意义
当酶促反应速度v=1/2 Vmax时，[S]=Km 。当酶促反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。
Km是酶的特征常数之一。
Km一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。不同的酶Km值不同。
②Km可表示酶与底物的亲和力
如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km，其中Km最小的底物称该酶的最适底物或一天然底物。
Km愈小（达到Vmax一半所需底物浓度愈小）表示底物与酶的亲和力愈大。
③相对速度（酶活性中心被占据分数Ys）
当v=Vmax时，v与[S]无关，只和[Et]成正比，这表明酶的活性部位已全部被底物占据，当v=1/2 Vmax时，表示活性部位有一
半被占据。
当一个Enzyme的Km已知，则任何底物浓度下酶活性部位的被占据分数。
④米氏方程所作曲线的曲度，不随Km和Vmax变化而变化。因此任何米氏酶，到达任何两个特定Vmax分数时，对应底物浓度之比为常数。
设达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9
0.9Vmax→[S]0.9
0.9Vmax=
0.9Km+0.9[S]0.9=[S]0.9
[S]0.9=9Km
同理有： [S]0.8=4Km
[S]0.7=2.33Km
[S]0.6=1.5Km
[S]0.5=1Km
[S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81
[S]0.7 /[S]0.1=21
0.9Km+0.9[S]0.9=[S]0.9
[S]0.9=9Km
4. Km和Vmax的求解方法
双倒数作图法
5. 多底物酶促反应
米--曼方程适用于单底物酶促反应，如异构、水解及部分裂合反应，不适用于多底物反应
三、pH对酶促反应速度的影响
1.pH影响酶活力的因素
A.影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。
B.影响酶分子中一些基团解离状态，尤其是酶活性中心残基的解离状态，最终影响ES形成。
C.影响底物分子中一些基团解离。
2．酶的最适pH
使酶促反应速度达到最大时的介质pH。大部分酶的pH活性曲线是钟罩形，
也有半钟罩形甚至直线形。
四、温度对酶促反应速度的影响
1．最适温度及影响因素（两个方面）
①加快反应速度 ②酶变性失活
温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，Q10一般为1－2。
温血动物体内的酶，最适温度35℃--40℃，植物体内的酶，最适温度40℃--50℃，细菌Taq DNA聚合酶70℃。
2.酶的稳定性温度
在一定条件、一定时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。
稳定性温度范围的确定方法。
酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。
酶的保存：
①液体酶制剂可以利用上述因素中的几种。
②酶干粉可在室温下放置一段时间，长期保存，应在低温冰箱中。
五、酶浓度对酶促反应速度的影响
如果底物浓度足够大，使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。
Vmax = K3 [E]
[S]过量且不变时，v∝[E]
六、激活剂对酶促反应速度的影响
凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。
提高酶活性：使酶活性进一步提高，离子或简单有机化合物。
激活酶原：无活性→有活性，离子或蛋白质。
1. 无机离子的激活作用
金属离子K+ 、Na+、Ca2+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+
阴离子Cl-、Br -
氢离子
A. 不同离子激活不同的酶。
B. 不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+，但有些可替代，例如 Mg+与Zn+。
C. 浓度适中，过高有抑制作用，1~50mM。
2.简单有机分子的激活作用
A.还原剂（还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有-SH的酶。
B.金属螯合剂（EDTA）能去除重金属离子，解除抑制作用。
七、抑制剂对酶促反应速度的影响
抑制作用：酶活力下降，但酶蛋白不变性。
应用
A.抑制剂型药物。
B.调控生物体的代谢途径，控制发酵。
C.研究酶的活性中心化学基团的功能，化学修饰酶。
（一）不可逆抑制作用
抑制剂与酶活性中心基团共价结合，使酶的活性下降，不能用透析法去除抑制剂。
1.非专一性不可逆抑制剂
酶分子的全部敏感基团
A. 有机磷
二异丙基磷酰氟酯（DFP）和许多有机磷农药。
与酶Ser的－OH结合（含活性中心），抑制某些蛋白酶及酯酶。
作用机理：抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱脂酶，乙酰胆碱积累，神经系统过度兴奋
B.有机汞、有机砷
许多有机汞、有机砷都是烷化剂，可以使酶的巯基烷化，还能与还原型硫辛酸反应。
可以加入过量的巯基化合物解除抑制。
半胱氨酸、GSH和巯基丙醇。
C.氰化物
与含铁扑啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。
D.重金属
Ag、Cu、Hg、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除抑制。
E.青霉素
与糖肽转氨酶的Ser－OH结合，抑制细菌细胞壁合成。
2.专一性不可逆抑制剂
此类抑制剂只与酶活性中心的特定基团反应。
A.Ks型专一性不可逆抑制剂（亲和修饰剂）
具有与底物相似结构，可以与酶特异结合，还有一个能与酶活性中心必须基团反应的活泼基团。
B. Kcat型专一性不可逆抑制剂（自杀性底物）
与底物结构类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应。
潜伏反应基团（latent reactive group）被酶催化而活化，并立即与酶活性中心的必须基团进行不可逆结合，使酶受到抑
制。
（二）可逆抑制作用 Reversible Inhibition
抑制剂与酶蛋白结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性。
1.竞争性抑制（Competitive inhibition）
底物的结构类似物竞争酶的活性中心，与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。
增加底物浓度可以解除此种抑制。
磺胺类药物的抗菌机理：对氨基苯磺酰胺是对氨基苯甲酸的类似物，
竞争性抑制二氢叶酸合成酶的活性。
2.非竞争性抑制
抑制剂与酶活性中心以外的基团结合，其结构可能与底物无关。
酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是中间产物ESI不能生成产物，降低了酶的活性。
不能通过增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。
3. 反竞争性抑制
酶只在与底物结合后，才与抑制剂结合。
E+S→ES+I ≠ P
（三）可逆抑制作用的动力学
1.竞争性抑制
[Et]=[E]+[ES]+[EI]
动力学方程
图 竞争性抑制曲线
竞争性抑制作用
（1） Vmax不变，Km变大。
（2） 抑制程度取决于[I]、[S]、Km和Ki
A. [I]不变，增加[S]，减小抑制程度。
B. [S]不变，增加[I]，增大抑制程度。
C. [I]和[S]不变，Ki越大，抑制作用越小。
D. [I]和[S]不变，Km值越低，抑制程度越小。
E. [I]=Ki时，双倒数图中直线的斜率加倍
非竞争性抑制
[Et] = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]
动力学方程
图 非竞争性抑制曲线
非竞争性抑制
（1） Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）。
（2）抑制程度去决于[I]和Ki ，与酶的Km和[S] 无关。
（3）定[I]和[S]不变， Ki越大，抑制作用越小。
3. 反竞争性抑制
[Et] = [E] + [ES] + [ESI]
动力学方程
图 反竞争抑制曲线
反竞争性抑制
（1）Km及Vmax都变小。
（2）双倒数方程的斜率不变。
第四节 酶的作用机理
一、专一性的机理
（一）酶专一性类型
1. 结构专一性 Specificity
（1）键专一性 限制键，不限制键两侧基团。
脂酶：R1－CO－OR2
（2）基团专一性 限制键，还限制键一端的基团，但不限制键另一端的基团。
α--D--Glc苷酶，水解蔗糖和麦芽糖。
（3）绝对专一性 只能催化一个底物，麦芽糖酶只催化麦芽糖水解，脲酶只催化尿素水解。
2. 立体异构专一性
（1）旋光异构专一性 Glu脱氢酶只催化L－Glu，乳酸脱氢酶只催化L－乳酸。
（2）几何异构专一性 反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成苹果酸。
立体化学专一性还表现在酶能催化对称分子中等同的两个基团中的一个，而对另一个无作用。
顺-乌头酸酶只催化柠檬酸两个-CH2COOH中的一个。
（二）酶专一性的解释
1.三点结合及锁钥模型（刚性模板假说）
酶活性中心的形状与底物分子形状互补。
底物分子或其一部分像钥匙一样，专一的插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶底物复合物。
酶活性中心的催化基团正好对准底物的敏感键，进行催化反应。
2.诱导楔合模型
酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物互补楔合，进行反应。
二、高效性的机理
1. 邻近效应与定向效应
酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近。同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于
发生。
对反应速度的影响
①使底物浓度在活性中心附近很高。
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用。
③酶使分子间反应转变成分子内反应。
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
2. 扭曲变形和构象变化的催化效应
酶分子中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力。
①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。
②底物扭曲、变形，利于形成ES复合物。
③底物构象变化，变得更接近过度态结构，大大降低活化能。
3. 共价催化
酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。
4. 酸碱催化
酶分子的一些功能基团起质子供体或质子受体的作用。
影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度 His咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵咪唑基给出质子或结合质子的速度最快。
5. 金属离子催化
6. 多元催化和协同效应
7. 活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子。
三、酶作用机理举例
1.胰凝乳蛋白酶的作用机理
（1）专一性
该酶需要底物有一个疏水基团，定位结合于酶上的疏水部位，使底物敏感键对准酶的催化基团。
疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp
三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部位 p408
胰凝乳蛋白酶--芳香环、大的非极性脂肪族侧链胰蛋白酶--带正电荷的Lys、Arg进入弹性蛋白酶--Ala等小分子非极性侧链进入
（2）催化机理 p410
① 活性中心-催化三联体
Asp102--His57--Ser195氢键体系。
His57的咪唑基桥梁。
通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。
Ser195成为亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。
第五节 多酶体系与酶活性的调节控制
一、多酶体系
1.多酶体系及其分类
多酶体系：在完整的细胞内，某一代谢途径由几个酶组成的反应链体系。
可溶性的（分散的）结构化的（多酶复合体）在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）
2.多酶体系的调节
（1）第一步反应往往是限速步骤，控制着整个反应速度。
（2）反馈抑制与底物激活催化第一步反酶，大应的多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制。有时反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反
馈抑制，有的被底物激活。
二、酶活性的调节
调节酶：活性可被调节的酶，主要有别构酶和共价调节酶。
（一） 别构调节 Allosteric regulation
酶分子的非催化部位与某些化合物非共价结合变化后构象，从而改变的酶活性。
别构效应物、别构剂，正效应物、负效应物
1. 别构酶的结构特点和性质
（1）别构酶一般是寡聚酶
（2）别构酶具有协同效应，正协同－S曲线，负协同－双曲线。
（3）K型效应和V型效应
K型效应－改变K0.5而不改变Vmax的效应
V型效应－改变Vmax而不改变K0.5的效应
（4）加热脱敏，无调节活性，同米氏酶。
2.别构酶的动力学曲线
（1）正协同效应的别构酶是S型曲线
当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1= 81
别构酶：[S]0.9/[S]0.1= 3
表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax。
（2）负协同效应的别构酶是近似双曲线
负协同效应的酶，反应速度对底物浓度的化不敏感 。
图 正负协同效应
3.别构酶调节活性的机理
（1）齐变模型（WMC）
（2）序变模型（KNF）
酶分子中亚基结合底物后，构象依次变化。
4.别构酶的鉴定[S]0.9／[S]0.1
Rs = 81 米氏酶
Rs ＜ 81 正协同效应
Rs ＞ 81 负协同效应
Hill系数：[S]0.9／[S]0.1＝ 81
n = 1 米氏酶
n ＞ 1 正协同效应
n ＜ 1 负协同效应
（二）可逆共价修饰调节
共价调节酶：酶分子被其它的酶催化，进行共价修饰，在活性形式与非活性形式之间相互转变。
举例：糖原磷酸化酶
（三）酶原的激活
具有不可逆性。此类酶主要有消化系统中的酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。
1.胰凝乳蛋白酶原的激活被胰蛋白酶激活
2.胰蛋白酶原的激活被肠激酶激活
图 胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的激活
3.消化系统中酶原的激活
（四）专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节
钙调蛋白、激素结合蛋白，促进或抑制特 异的酶活性。
（五） 同工酶
能催化同一种化学反应，但酶蛋白的分子结构不同的一组酶。存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中。
哺乳动物乳酸脱氢酶(LDH)有5种
CH3CHOH-COO-+NAD+ CH3COCOO-+NADH+H+
由H和M二种亚基组成HHHH在心肌中占优势，HHHM，HHMM，HMMM，MMMM在骨骼肌中占优势。
酶组成酶和诱导酶
组成酶：正常细胞内存在的酶，含量较稳定，受外界因素影响小。
诱导酶：正常细胞中含量极少或没有，加入特定诱导物后产生的酶。诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。
例如，大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶。
在含Glc的培养基中。
在只含乳糖的培养基中。
Glc-β(1→4)Gal苷。
第三章 维生素与辅酶
维持生物正常生命过程必需的一类小分子有机化合物。在生物体内含量极少，大多数由食物供给，生物体自身不能合成。
脂溶性: A、D、E、K，单独具有生理功能。
水溶性: B1、B2、B6、B12、C，辅酶。
基本功能: P434 表11－1
第一节 脂溶性维生素
一、维生素A和胡萝卜素
1. 结构
化学名称：视黄醇 retinol
A1: 哺乳动物及咸水鱼
A2: 淡水鱼
2.维生素A的来源
β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、黄玉米色素等在肝脏、肠粘膜内转化成A。
β-胡萝卜素可转化成2个维生素A（有色蔬菜）
α-胡萝卜素
γ-胡萝卜素 转化成一个维生素A
黄玉米色素
3.功能（与视觉有关）
活性形式：11-顺式视黄醛
缺乏症：夜盲症
视紫红质为弱光感受物，当弱光射到视网膜上时，视紫红质分解，并刺激视神经而发生光觉。
11-顺式视黄醛在暗光下经视网膜圆柱细胞作用后，与视蛋白结合成视紫红质，形成一个视循环。
当全反视黄醛变成11-顺式视黄醛时，部分全反视黄醛被分解为无用物质，故必需随时补充维生素A，每日补充量1.0mg。
二、维生素D（D2和D3。）
D2－麦角钙化醇， D3－胆钙化醇。
1.来源
动物体内有维生素D，植物体内一般不含维生素D（但有维生素D原）。
鱼肝油、蛋黄、牛奶、肝、肾、皮肤组织等富含维生素D。
酵母、真菌、植物中：麦角固醇（D2原）
动物体内：7-脱氢胆固醇（D3原）
2.结构
麦角固醇 (R) 维生素D2 （麦角钙化醇）
7-脱氢胆固醇（皮肤）(R) 维生素D3 （胆钙化醇）
3.功能
调节钙磷代谢，维持血中钙磷正常水平，促进骨骼正常生长。
缺乏症：佝偻病
活性形式：1，25-二羟基胆钙醇
维生素D3（胆钙化醇）→25-羟基胆钙醇（肝脏）→1，25-二羟基胆钙醇（肾脏）→小肠（促进Ca2+ 的吸收、运输 ）及骨骼（促进
Ca2+的沉积 ）中，参与调节钙磷代谢。
三、维生素E 化学名称生育酚，共有8种，直接具有活性。
1.结构 α-生育酚
2.来源
动物油、植物油（麦胚油、玉米油、花生油、棉子油）、蛋黄、牛奶、水果等。
3.功能（抗氧剂-抗油脂氧化）
生理功能：抗生殖不育、肌肉委缩、贫血、血细胞形态异常。
机理：有抗氧化活性，能防止不饱和脂肪酸自动氧化，保护细胞膜，延长细胞寿命。还可保护巯基酶的活性。
四、维生素K（ K1、K2、K3）
1.结构
2.来源
食物和肠道微生物合成；绿色蔬菜、动物肝脏、牛奶、大豆；大肠杆菌、乳酸菌。
3.功能－促进凝血
缺乏症：肌肉出血、凝血时间延长凝血过程中，许多凝血因子的生成与维生K有关
①凝血酶原 因子II
②转变加速因子前体 因子VII
③血浆凝血酶激酶 因子IX
④司徒氏因子 因子X
第二节 水溶性维生素与辅酶
主要是B族维生素，绝大多数是辅酶
一、 维生B1与焦磷酸硫胺素（TPP）
化学名称：硫胺素
活性形式：焦磷酸硫胺素（TPP）
1.结构
硫胺素 + ATP TPP + AMP
硫胺素激酶
2.来源 瘦肉、酵母、谷类的胚芽、皮层
3.功能（TPP）
脱羧酶的辅酶
缺乏症：脚气病、多发性神经炎
TPP是催化丙酮酸、α-酮戊二酸脱羧的辅酶。
噻唑环C-2上氢解离，使C-2变成负碳离子，可以与α-酮酸的羧基碳结合，形成中间物脱羧。
二、维生素B2与黄素辅酶（FAD、FMN）
化学名称：核黄素
1.结构
活性形式：
FMN，还原型FMNH2
FAD，还原型FADH2
核黄素+ATP→FMN+ADP
FMN+ATP→FAD+ppi
2.来源
肝脏、酵母、大豆和米糠等
3.功能
FMN、FAD作为氧化还原型辅酶，可分别与酶蛋白结合构成脱氢酶，辅酶传递氢。
酶 底物 产物 辅酶
D-a.a氧化酶 D-a.a α-酮酸 FAD
羟基乙酸氧化酶 羟基乙酸 乙醛酸 FMN
琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 反丁烯二酸 FAD
三、维生素B3－泛酸与辅酶A（CoA）
维生素B3也称泛酸，是辅酶A的组成部分。
1.结构 VB3（泛酸）
2.功能
活性位点：-SH
功能：辅酶A能与乙酰基结合，生成乙酰辅酶A。
乙酰辅酶A是乙酰基的载体，可转运乙酰基。
脂酰基载体，转运脂酰基。
四、维生素B5与烟酰胺辅酶
维生素B5包括烟酸（尼克酸）、烟酰胺（尼克酰胺），烟酰胺是合成NAD、NADP的前体。
NAD、NADP是各种脱氢酶的辅酶。
MH2+NAD+→M+NADH+H+
酶 底物 产物 辅酶
醇脱氢酶 乙醇 乙醛 NAD+
异柠檬酸 异柠檬酸 α-酮戊二酸 NAD+或NADP+
脱氢酶
五、维生素B6与磷酸吡哆醛辅酶
维生素B6包括：吡哆醛、吡哆胺、吡哆醇。
活性形式：磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛。
功能：磷酸吡哆醛转氨酶、磷酸吡哆胺转氨酶
六、生物素与羧化辅酶
化学名称：生物素
生物素的结构
七、维生素B11
维生素B11又名叶酸，喋血谷氨酸。
活性形式：四氢叶酸（THF），传递一碳单位。
传递的一碳单位有：甲基、亚甲基（甲叉）、甲川基、甲酰基、亚胺甲基。
活性位点：N5、N10
八、维生素B12
化学名称：钴胺素。
5'-脱氧腺嘌呤核苷酸钴胺素是甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的辅酶。催化L-甲基丙二酸单酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A。
九、硫辛酸
丙酮酸脱羧酶复合体中的辅酶。
十、维生素C
1.结构
化学名称：抗坏血酸
2.来源 食物
3.功能 抗氧化剂
缺乏症：坏血病、毛细血管脆弱、牙龈发炎出血
Chapter 4 Nucleotides and Nucleic Acids
4.1 Components of Nucleic Acids
一、Base Pyrimidine and Purine
1. Purine Adenine、 Guanine
2. Pyrimidine Cytosine、Uracil、Thymine
3. Modified Base
100余种，多数是甲基化的产物，植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C
二、核苷与脱氧核苷
糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。
核酸中的核苷均为β-型核苷。
三、核苷酸
核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化。
1. 构成DNA、RNA核苷酸
2. 细胞内游离核苷酸及其衍生物
①核苷5'-多磷酸化合物
ATP、GTP、CTP在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。
②环核苷酸
3'、5'-cAMP ; 3'、5'-cGMP激素的第二信使，cAMP调节糖代谢、脂代谢。
③核苷5'多磷酸3'多磷酸化合物ppGpp 、pppGpp、ppApp
④核苷酸衍生物
HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等的辅助因子。
在糖蛋白生物合成中，GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是活性的糖基供体。
4.2 DNA
Primary Structure－Sequence
Secondary Structure－Double Helix
Tertiary Structure－Folding Conformation
一、Primary Structure
dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3',5'-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。
3',5'-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构。
书写方法：5' → 3' 5'-pApCpTpG-3'或5'...ACTG...3' 真正代表DNA生物学意义的是碱基排列顺序。
二、DNA的二级结构
1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA钠盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。
Chargaff 规律（ 1950年）
a. DNA中，A=T，G=C 。（A+G = C+T）
b. DNA碱基组成具有物种的特异性。
c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。
d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。
1. Watson-Crick结构模型（B-DNA）P489
★ 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴缠成右手双股螺旋，一条5'→3'，另一条3'→5'。
★ 嘌呤与嘧啶碱基位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋的外侧。
★ 磷酸与脱氧核糖通过3', 5' -磷酸二酯键连接，构成DNA分子的骨架。
★ 大沟：宽0.2nm ，深0.85nm。小沟：宽0.6nm，深0.75nm。
★ 双螺旋平均直径2.37nm 每圈螺旋含10.4个碱基 碱基堆积距离：0.34nm 螺距：3.32nm
★ 两条核苷酸链，依靠碱基间形成的氢链结合在一起。A=T, G=C
2. 稳定双螺旋结构的因素
①碱基堆积力，形成疏水环境。
②碱基配对的氢键，GC含量越多，越稳定。
③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。
④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性小分子的攻击。
三、DNA二级结构的多型性 A、B、Z-DNA
1. B-DNA 典型的Watson-Crick双螺旋DNA。 右手双股螺旋
2. A-DNA 右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。
3. Z-DNA 左手双螺旋DNA。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。
4. DNA三股螺旋（ H-DNA）和四股螺旋
DNA三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点。
第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。
TAT、C+GC两种碱基配对方式。
四、DNA二级结构的不均一性
1.反向重复序列（回文序列）
DNA序列以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。
较长的回文结构，可形成发夹结构和十字结构，与转录的终止有关。
较短的回文结构往往是限制性核酸内切酶的识别位点。
5-GGTACC-3
3-CCATGG-5
五、环状DNA
某些病毒DNA
某些噬菌体DNA
某些细菌染色体DNA
细菌质粒DNA
真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA
1.环状DNA的不同构象
松驰环 解链环和负超螺旋
（1）松弛环形DNA 线形DNA直接环化。
（2）解链环形DNA 线形DNA拧松后再环化。
（3）正超螺旋与负超螺旋DNA
正超螺旋：线形DNA双链（右手螺旋）一端固定， 另一端向缠紧的方向旋转几圈，再将两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋（ DNA双链间），以解除
外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。
负超螺旋：线形DNA双链（右手螺旋）一端固定，另一端向松弛的方向旋转几圈，再将两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋（ DNA双链间）以解除外加
的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫负超螺旋。
2. 环形DNA的拓扑学特性
以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4 = 25
①连环数（L）
DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。
松驰环：L=25
解链环：L=23
超螺旋：L=23
②缠绕数（T）
DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示
松驰环T = 25
解链环T = 23
超螺旋T = 25
③超螺旋数（扭曲数W）
松驰环W = 0
解链环W = 0
超螺旋W = -2
L = T + W
④比连环差（λ）
表示DNA的超螺旋程度。
λ=（L - L0）/L0
L0是指松驰环形DNA的L值。
天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03---0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。
负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，容易解链，有利于DNA的复制、重组和转录。
3.拓扑异构酶
改变DNA拓扑异构体的L值。
①拓扑异构酶I（拧紧）
能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1。
②拓扑异构酶II（拧松）
能使正超螺旋转变成松驰DNA。每次催化使L减少2。
六、染色体结构
1. 大肠杆菌染色体
大肠杆菌染色体是由4.2×106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。
大肠杆菌DNA结合蛋白： 每个细胞
H 两个28KD的相同亚基 30000个二聚
HU 两个各9KD的不同亚基 40000个二体聚
HLP1 17KD的亚基 20000个单体
P 3KD的亚基 未知
大肠杆菌DNA（ 4.2×106bp ）与结合蛋白压缩成手脚架结构，中心是多种DNA结合蛋白。
DNA上有多个位点与这些蛋白结合，形成约100个小区。每个小区的DNA都是负超螺旋，两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。
用极微量的DNA酶I处理时，只能使少数小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。
2．真核生物染色体（组蛋白和DNA组成）
组蛋白富含碱性氨基酸，根据Lys/Arg比值不同，分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均是单链蛋白质，分子量
11000-21000。
H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成八聚体。
146bp长度的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。核小体间DNA长度15-100bp，其上结合H1。
2H2A、2H2B、2H3、2H4八聚体。
146bp DNA
核小体 串联 染色质 折叠 染色体
DNA（直径2nm）
盘绕组蛋白，结合H1，压缩比1/7
核小体
螺旋化，压缩比1/6
螺线管
再螺旋化，压缩比1/40
超螺线管
折叠，压缩比1/5
染色单体
总压缩比：1/8400~1/10000
4.3 RNA的结构
一、RNA的一级结构
AMP、GMP、CMP、UMP通过3'、5'磷酸二酯键形成的线形多聚体，组成RNA的戊糖是核糖。
RNA的U替代DNA中的T，RNA中常有一些稀有碱基。
天然RNA分子是单链线形分子，部分区域有A-型双螺旋结构。
RNA的类型
核糖体RNA： rRNA
转运 RNA： tRNA
信使 RNA： mRNA
内小RNA： snRNA （small nuclear RNA ）
二、tRNA的结构
70－90b，分子量25kd左右，沉降系数4S左右。有较多稀有碱基。
3'端是...CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。
5'末端大多为pG...或pC...
二级结构是三叶草形。
三、mRNA的结构
1.真核mRNA（P）
（1）3'端有20-250核苷酸的polyA。
polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA其polyA较长；衰老的mRNA其polyA较短。
polyA功能：PolyA是mRNA进入胞质的必需形式。
PolyA提高mRNA在胞质中的稳定性。
（2）5'-帽子
帽子结构： 3'-mG-5'ppp5'-Nm-3'-P
5'末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5'-5'-磷酸二酯键。
功能：抵抗5'核酸外切酶降解mRNA。
为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。
2.原核mRNA
由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5'帽子和3'polyA。
SD序列：5'端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5'-AGGAGGU-3'，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由
Shine和Dalgarno发现，称SD序列。
SD序列和核糖体16S的rRNA的3'末端富含嘧啶碱基的序列互补。
四、rRNA的结构
rRNA与核糖体结合蛋白一起构成核糖体。
大肠杆菌中有三类rRNA（原核）：
5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA
真核细胞有四类rRNA：
5S rRNA、5.8S rRNA、18SrRNA、28S rRNA23S rRNA能够催化肽键的合成。
图 大肠杆菌5S rRNA结构
16 S rRNA
4.4 核酸的性质
一、水解性质
1.碱水解
室温条件下，0.1mol/L NaOH可将RNA完全水解，得到2'-或3'-磷酸核苷的混合物。在相同条件下，DNA不被水解。因为RNA中
C'2-OH的存在，促进磷酸酯键的水解。
DNA稳定---储存和传递遗传信息
mRNA是DNA的信使---完成任务后迅速降解
2.酶水解
RNA水解酶 RNase
DNA水解酶 DNase
核酸外切酶
核酸内切酶 限制性核酸内切酶
二、解离性质
磷酸和碱基能发生两性解离。
DNA等电点 4-4.5
RNA等电点 2-2.5
三、光吸收性
碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有较强的光吸收性，λmax=260nm
1.鉴定纯度
纯DNA：A260/A280 ＝1.8（1.65-1.85）若大于1.8，表示污染了RNA或DNA降解
纯RNA：A260/A280 ＝2.0若有杂蛋白或苯酚，则A260/A280明显降低
2.含量计算
1.0 ABS相当于50ug/mL双螺旋DNA或40ug/mL单链DNA（或RNA）或20ug/mL核苷酸
3.增色效应与减色效应
增色效应：DNA变性时，摩尔吸光系数增大。
减色效应：DNA复性时，摩尔吸光系数减小。
四、沉降特性（DNA）
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速度不同，用CsCl密度梯度离心可密度和沉降速度不同，用CsCl密度梯度离心可以将它们
区分开来。这一方法常用于质粒DNA的分离纯化。
相对沉降常数
线型双螺旋分子 1.00
松驰双链闭环 1.14
切刻双链环 1.14
单链环 1.14
线型单链 1.30
正超或负超螺旋双链环 1.41
坍缩 3.0
图 CsCl密度梯度离心
五、变性与复性
1.变性
核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链。
变性发生在一个很窄的温度范围内。
因素：热、酸碱（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）
现象：吸光度升高，粘度降低，密度升高。二级结构改变，部分失活。
（1）熔解温度（Tm）
DNA双螺旋结构解链50%时的温度浓度50ug/mL时，双链DNA的A260=1.00
完全变性 A260= 1.37
当A260增加到最大增加值一半时（ 1.185 ），对应的温度即为Tm。
DNA的Tm一般在70－85℃之间。
（2）影响DNA Tm值的因素
A.DNA均一性
均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。
B.G-C含量与Tm值成正比
测定Tm，可推知G-C含量。
G-C%=（Tm-69.3）×2.44
C.离子强度
离子强度越高，Tm越高。
2. 复性
变性的DNA在适当（一般低于Tm 20－25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。
缓慢冷却时可以复性，快速冷却时不能复性。
DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。
复性速度可用Co*t衡量。
Co是变性DNA的起始浓度mol*L-1
t是时间（秒）
★1个核苷酸对（AU），若浓度为Co=1.0mmol/L，50%复性时，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部复
性，Cot=10-4， t=0.1秒
★E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，复性50%，Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，115
天。复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，约5758天。
★复性机制：10-20bp成核，拉链。
4.5 核酸研究技术
一、核酸的分离纯化
保持天然状态。
条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。
抑制核酸酶。
1.DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1 mol/L NaCl），不溶于0.14 mol/L的NaCl中。利用此性
质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。
DNA核蛋白可用水饱和酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿-异戊醇去除蛋白质
2.RNA的分离纯化（mRNA的分离、纯化）
用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀， RNA核蛋白（RNP）在上清液中。
去蛋白：盐酸胍、苯酚等。
必须防止RNA酶对RNA的破坏。
二、核酸的凝胶电泳
1.琼脂糖电泳
①核酸分子大小 迁移率与分子量的对数成反比。
②凝胶浓度超螺旋最快，线形其次，松弛环最慢。
③DNA的构象
④ 电压5V/cm
DNA 琼脂糖电泳
2.PAGE电泳
三、限制性核酸内切酶
1. 限制修饰作用
2.II型核酸内切酶
限制、修饰活性分开，单体蛋白，辅助因子Mg2+，位点序列反向重复。
II型酶的切割频率
识别位点： 4 44 = 256
6 46 = 4096
8 48 = 65536
限制酶的命名：E.coRI
第一位属名，大写E
第二、三位种名的头两个字母，小写co
第四位菌株R
第五位从该细菌中分离出来的这一类酶的编号
EcoRI酶切位点
同裂酶：来源不同的限制性核酸内切酶（名称不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。
例1：BamHI GG↓ATCC ，BstI GG↓ATCC
例2：MboI GAT↓C， Sau3A GAT↓C
同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，切割后都产生相同的粘性末端。
例: BclI TG↓ATCA， BglII AG↓ATCA
四、 分子杂交
1. Southern Blotting
Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，可用DNA或RNA探针
五、DNA序列分析
1.化学裂解法
利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一放射性标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸
片段的PAGE上分离。
硫酸二甲酯特异切割：G
甲酸特异切割：G和A
肼在NaCl条件下切割：C
肼在无 NaCl条件下切割：T和C
32P *ACTTCGACAA
硫酸二甲酯（G）： *ACTTC
甲酸（G、A）： *P
*ACTTC
*ACTTCG
*ACTTCGAC
*ACTTCGACA
32P *ACTTCGACAA
肼（NaCl）（C）： *A
*ACTT
*ACTTCGA
肼（无NaCl）（C、T）： *A
*AC
*ACT
*ACTT
*ACTTCGA
图 化学法测定DNA一级结构
2.双脱氧终止法
英国Sanger1955年测定牛胰岛素结构，获诺贝尔化学奖。
1980年设计出DNA测序法，获诺贝尔化学奖。
策略
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
3.杂交测序
在1.6cm2 的芯片上合成48（65536）种8-mer寡核苷酸。
原理:如果一段较短的DNA探针(8)能够同较长的靶DNA片段杂交，并形成完全的双链分子，那么可据此推断在靶DNA上存在着相应的互补序
列。
A.将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交。
B.对那些能够同靶DNA形成完全双链体分子的寡核苷酸探针之间的碱基重叠关系作比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列结构。
例如，将5--AGCCTAGCTGAA--3的12-mer的靶DNA，同一组完全的8-mer的寡核苷酸探针混合杂交。
在这一组由总数为48（65536）种的8-mer寡核苷酸组成的完全的探针群体中，仅有5种会同靶DNA形成完全互补的双链体分子。
根据这5种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶DNA分子的核苷酸顺序。
图 杂交测序-1
图 杂交测序-2
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