Primer dan keberhasilan PCR

[Achmad Farajallah]

bio57: pak saya ingin bertanya, primer untuk pcr itu kan terbuat dari potongan RNA atau DNA, nah untuk tau potongan DNA atau RNAnya yang bisa dipakai sebagai primer itu bagaimana ya pak?

AFM: primer adalah potongan DNA dg ukurn sekitar 18-35 nukleotida.
Yg diamplifikasi adalah DNA, bukan RNA.
Jadi, kalo sampel kita adalah RNA maka harus diubah terlebih dahulu menjadi DNA menggunakan enzim reverse transcriptase. Setelah jadi DNA (namanya copyDNA atau cDNA) kemudian diamplifikasi dg PCR.

Apa alasannya harus diubah terlebih dahulu ke DNA?
molekul RNA tidak stabil. Setelah molekul RNA keluar dari sistem maka dia akan cepat rusak. Agar tidak rusah diubah terlebh dahulu ke DNA yg sangat stabil.

bio57: baik pak lalu untuk mengetahui potongan DNA seperti apa yang bisa dipakai sesuai dengan kebutuhan kita bagaimana ya pak?

AFM: Iya runutan nukleotida potongan DNA itu adalah seperti yang kita inginkan, yi yg bisa menempel di runutan DNA kita.

Oke, mari kita mengitung peluang.
Kita akan menemukan A jika mencari di 4 nukleotida (nt, sering juga disebut basepair atau bp) = 4^1 (baca: 4 pangkat 1).
Kita akan menemukan AG jika mencari di 4^2 atau 16 bp, dst (AGC = 4^3, AGGG = 4^4, AGCTT =4^5, dst).
Panjang primer sekitar 20 nt. Artinya, kita akan menemukan runutan DNA primer jika mencari di 4^20 nt (= 1.099.511.627.776 nt atau 1x10^12 nt).
Ukuran genom vertebrata sekitar 3x10^9.
Jadi primer dengan panjang 20 nt peluangnya sangat kecil bisa menempel di beberapa tempat. Dengan kata lain, primer hanya akan menempel di ruas DNA yang kita inginkan.

Bio57: Saya ingin bertanya mengenai proses pcr yang dilakukan berdasarkan hasil elektroforesis, itu ada yang namanya proses amplifikasi gen target (contohnya 16s rRna), saya jadi penasaran hal apa ya pak yang mempengaruhi berhasil atau tidaknya proses amplifikasi tersebut?

AFM: Tolong lihat lagi jawaban sy thdp pertanyaan tentang primer diatas.
Kemudian, dalam reaksi PCR ada DNA cetakan (sampel), sepasang primer, dNTPs (dATP, dCTP, dTTP & dGTP) dan enzim polimerase.
Pasangan primer akan menempel di ruas DNA yg kita inginkan. Misalnya gen target kitar 16SrRNA. Maka kita mendesain runutan DNA primer sesuai dengan runutan DNA yg ada di gen 16SrRNA. Atau kalo tidak mendesainnya sendiri, kita bisa mencontek runutan primer dari artikel publikasi yg sudah terbit.
Berhasil tidaknya amplifikasi (PCR): pengaturan suhu, primer nempel atau tidak, pereaksi2 lainnya, dan ada tidaknya DNA cetakan atau sampel.

AFM: Walau redaksinya tidak dimengerti, tetapi saya mengerti apa yang akan ditanyakan.
Silakan pertanyaannya dicocokkan dg alur kerja sbb:
1. Sampel DNA: menangkap hewan -> ambil sel/jaringan -> ekstraksi DNA
Dalam hal sampel RNA, maka ada tahap RNA diubah terlebih dahulu ke DNA
2. Mendesain primer
3. Amplifikasi PCR: memasukkan semua pereaksi PCR ke mesin thermal cycler
4. Mengecek hasil PCR dengan elektroforesis
5. Menentukan runutan nukleotida hasil amplifikasi PCR (=DNA sequencing)
6. Analisis DNA