Pewarnaan

[Achmad Farajallah]

Dear All,

Salah satu keunggulan teknik pewarnaan adalah bisa mengatasi indeks refraksi (indeks pembiasan) mengikuti aplikasi mikroskop cahaya. Selama pembiasan cahaya oleh suatu material (terlarut) itu sama dg latar belakang (pelarut) maka si material tidak akan bisa kita lihat.
Jika kemudian material enda terlarutnya diwarnai sehingga indeks refraksinya berbeda dengan latar belakang ....maka kita bisa melihatnya.

Setidaknya ada dua cara pewarna warna bisa mewarnai material:
1. menyelusup ke celah-celah material
contoh: mewarnai DNA. Material pewarna menyelusup ke ruang-ruang lipatan untai DNA.
2. bereaksi (membentuk ikatan)
contoh: mewarnai protein. Material warna membentuk ikatan dg gugus amin

Pengelompokan awal berdasarkan pH sehingga ada pewarna yg bersifat
1. asam
2. netral
3. basa (basic dye)

Ada juga yg mengelompokkan pewarna setelah ada efek dari si pewarnanya, yaitu
1. warna menyebabkan sel mati (karena molekul warna mengikat molekul fungsional)
2. vital dye - masuknya warna tidak menyebabkan sel mati
Salam
AFM
====

bio57: Permisi pak, terkait pewarnaan saya teringat laporan praktikum mata kuliah lain dimana ada pewarnaan endospora dan eksospora. Pewarnaan endospora terdeteksi dengan malachite green namun eksospora tidak dapat dideteksi, pertanyaan saya mengapa eksospora tidak dapat diwarnai dengan malachite green dan apakah ada metode lain untuk dapat mendeteksi kehadiran eksospora dalam sel bakteri?

AFM: Saya tidak tahu sifat dari pewara malachite. Silakan di-gugling aja, material apa saja yg bisa diwarnai oleh malachite
Ketika kita memilih pewarna, maka target material yg akan diwarai harus dipertimbangkan. Di pasar, tersedia beragam jenis pewarna (dan atau labelling)
Dalam hal malachite, pastinya ada peneliti terdahulu yg menemukan bhw malachite hanya bisa berikatan dengan molekul yg hanya ada di endospora; dan tidak ada di eksospora.
====

[Achmad Farajallah]

Bio57: Hal-hal apakah yang dapat menyebabkan rendahnya kemurnian pada hasil elektroforesis DNA ?

AFM: Penyebabnya banyak.
Salah satunya: materialnya tidak murni
Elektroforesis - memisahkan material di dalam matriks yang ditarik medan listrik. Kalau di dalam sampel ada beragam material yg berespon berbeda thdp gaya listrik dan atau berespon berbeda terhadap ukuran pori matriks -> maka hasil elektroforesis berbeda.
Kenapa tidak murni?
berarti pemisahannya kurang sempurna

bio57: Apakah ada tahapan isolasi yang kurang Pak ?, Jika ada pada tahapan yang mana ya Pak ?
bio57: apakah pengikatan DNA yang kurang maksimal saat proses binding DNA juga termasuk salah satu faktor pak?

AFM: Jika sel digerus dan langsung diaplikasikan ke elektroforesis, kemudian kita kasih warna yg universal (beragam moleku bisa terwarnai) -> maka kita akan bilang bhw hasil elektrosesisnya kotor.
Solusi:
1. kita lakukan pemisahan agar materialnya lebih murni,
atau
2. kita aplikasikan pewarna yg spesifik thdp hanya hanya material target.

bio57: Ohiya Pak, apakah ada artikel yang relevan terhadap pernyataan ini ?, Saya mendapatkan artikel berbahasa Indonesia yang menurut saya agak kurang sesuai Pak

AFM: Ndak perlu pake artikel mbak. Logika saja bahwa sel adalah gudang bahan kimia.
Kalau sel digerus dan langsung diaplikasi ke elektroresis maka semua material akan berorientasi mengikuti gaya tarik listrik dan ukuran pori maktriks.
Kalau kemudian dikasih pewarna universal -> maka semua bahan kimia akan terwarnai;
Sebaliknya, kalo kita mennggunakan pewarna spesifik -> maka hanya molekul target yg terwarnai secara spesifik.

AFM: Sepertinya ada missed.
Kalo kita ekstraksi DNA dari jaringan (bukan sel tunggal), misalnya ada 100 sel, maka kita akan memperoleh 100 genom.
Jika kita bekerja secara hati-hti shg tidak ada molekkul DNA yg terpotong-potong maka setelah elektroforesis akan menampilkan 1 pita saja.
Jika ada yg terpotong-potong karena kerjanya agak jorok maka akan menampilkan banyak pita.
Selain itu, kalo ada sel yg lain dalam sampel (misalnya parasit atau patogen) maka juga akan menampilkan banyak pita.

Jadi, kalo kita melihat banyak pita, maka ada 2 peluangnya:
1. kerja kita jorok
2. sampel tidak murni

bio57: Untuk nilai OD260/OD280 apabila diperoleh hasil <1,6 - 2,0 apakah dapat dikatakan sampel isolat tersebut mengandung banyak protein dan asam amino Pak ?
Karena untuk kemurnian DNA sendiri dikatakan baik apabila >1.6 - 2.0 (Khare et al. 2014)
A260= DNA
A280= protein, asam amino
A230= komponen organik
kalau dari jurnal,
<1,6= dna terkontaminasi tapi saya kurang tahu ini terkontaminasi apa Pak ??

AFM: Beneran ada missed ... hehehe... sorry
Tak kira hasil eketroforesis yang kemudian diwarnai.
Yg mbak tanyakan adalah hasil ektraksi (pemisahan) DNA.
Untuk mendeteksi apakah dalam tabung hanya ada DNA, maka kita tembak dengan sinar uv panjang gelombang A260. Intensitas uv yang masuk akan diserap oleh material DNA sehingga intensitas yg keluar (yg terdeteksi) akan berkurang. Jumlah uv yg diserap = konsentrasi DNA..
thats all.
Kemudian sampel yg sama ditembak dengan panjang gelombang A280. Jumlah uv yg diserap = konsentrasi protein.
Jika hasil 2x pengukuran itu dibuat rasio dan ternyata konsentrasi proteinnya lebih tinggi dari DNA maka kita sebut proses ektraksi kurang bersih.
sorry...angka2 rasionya saya lupa. Saya ndak pernah mikir murni atau tidak murni hasil ekstraksi yg saya lakukan. Karena downstream methods-nya adalah PCR. Jadi walau dalam sampel masih banyak mengandung protein...its oke. PCR hanya mengamplifikasi ruas DNA yang saya inginkan.

AFM: Sama halnya dg test swab PCR covid.
Setelah sel-sel epitel dan lendir diperoleh -> dilisis -> RNA dipisahkan.
Dalam hal ini ndak perlu murni-murni banget.
Toh..., setelah itu RNA akan diubah menjadi DNA dan DNA diperbanyak melalui PCR.
Artinya walau masih ada protein dan bahan organik lain dalam sampel... its oke.

Kecuali kita mau mempeljari si molekul DNA-nya itu sendiri (dalam konteks biokimia).  

--
You received this message because you are subscribed to the Google Groups "biosel_ipb" group.
To unsubscribe from this group and stop receiving emails from it, send an email to biosel_ipb+...@googlegroups.com.
To view this discussion on the web visit https://groups.google.com/d/msgid/biosel_ipb/CAOLmf%3DFMgvvXGmMm-sS4Z%3DApqwzkF4%3D3FD_Q9H6tGiW8kM7abA%40mail.gmail.com.